基于非靶向风味组学分析3 种品牌啤酒的风味差异

陈华磊，黄克兴，郑 敏，杨朝霞

（青岛啤酒股份有限公司，啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东 青岛 266100）

啤酒作为世界第三大饮品，其富含人体所需的各种氨基酸、维生素及营养成分[1-2]，被誉为“液体面包”，它具有促进消化，增强脾脏活动，增加食欲等功能[3]。感官风味是啤酒重要的特征指标，由于生产过程中所使用的原料及酿造工艺不同，导致不同品牌啤酒风味上存在差异。消费者则根据其喜好，选择适合的产品以满足身心愉悦的需求。因此，准确区分不同品牌啤酒的特征风味对产品质量优化及真实性鉴别等研究存在重要意义。

众所周知，不同品类啤酒（如Lager啤酒、小麦啤酒、黑啤酒、印度淡色艾尔啤酒等）间的风味存在较大差异，很容易通过感官加以区分。而相同品类啤酒则辨识度不及前者，但酵母菌种及发酵工艺的差异也对它们之间的风味造成细微差别，这些差异只有资深的忠实消费者或专业品评人员才有可能察觉。

近年来，顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技术因具有良好的灵活性及选择性[4-5]，被普遍应用于食品及啤酒等酒精饮料的挥发物研究[6-10]。随着化学计量学的发展及高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）的广泛应用，啤酒风味成分的检测方法得到进一步优化，相关风味差异分析的研究也取得了相应进展。HRMS的超低检测限使其成为鉴定痕量物质的首选。该技术已成为啤酒指纹识别及分类研究的有效工具[11-14]。

风味组学[15]是继基因组学[16]、蛋白组学[17]、代谢组学[18]、食品组学[19]及感官组学[20]后又一新兴的研究领域，是系统风味研究的重要组成部分，旨在分析样品中全部小分子风味化合物成分及其动态变化。非靶向技术面向所有能检测到的挥发性物质，全面反映整体风味变化，并通过多元统计分析筛选关键风味标记物。Gonçalves等[21]采用HS-SPME结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）及多元回归分析建立啤酒原料中挥发物代谢组学的研究模式。Hughey等[22]利用高分辨质谱及组学技术绘制了工坊啤酒的分子指纹图谱，并利用建立的数学模型对混合酒花酿造的IPA啤酒进行预测。Harmonie等[23]对160 个品种的传统啤酒大麦进行非靶向组学分析，研究大麦品种对啤酒风味的影响。Tomáš等[24]进行捷克啤酒与捷克以外的其他欧洲啤酒的感官组学差异分析。

目前Lager啤酒仍然是啤酒消费市场的主流品类，本研究选取国内销量最大、销售范围最广的3 个品牌的Lager产品作为研究对象，利用HS-SPME-GC-MS结合风味非靶向组学技术对其风味差异进行研究。将样品的质谱信息作为化学计量分析数据，利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）法及随机森林分类（random forest classifier，RFC）法提取相关信息，再结合组学原理对其结果进行分析，并参照国际标准质谱数据库对关键风味化合物进行鉴定。本方法对类似的饮料风味的研究也同样具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集国内A、B、C 3 种品牌的8˚P Lager成品啤酒各8 批次，共计24 批次（表1）作为样品置于4 ℃冰箱冷藏，待分析检测时回温至室温。

表 1 样品信息Table 1 Information about samples tested in this study

1.2 仪器与设备

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纤维 美国Sigma-Aldrich公司；6890 GC/5975A GC-MS联用仪、HP-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

啤酒样品排气后，取4.5 mL置于20 mL顶空瓶中，预平衡1 min，室温萃取5 min。为验证仪器的稳定性，本方法将测试样品按等比例混合配制成质量控制样品，与被测样品同步进行分析。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS条件

将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维在室温条件下插入待测样品的顶空瓶中进行顶空微萃取5 min，再将萃取纤维插入GC-MS系统的进样口解吸5 min；使用HP-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分离；载气为He，流速1.3 mL/min。升温程序：初始温度30 ℃，保持2 min；然后以2 ℃/min升温至45 ℃，并以3 ℃/min升温速率升至120 ℃保持2 min；最终以6 ℃/min升至230 ℃保持5 min。

化合物通过5975A EI-MSD进行质量分析：离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z29～550。将扫描所得质谱图与美国国家标准与技术研究院颁布的标准质谱库（NIST/EPA/NIH Mass spectral Library Version 2.2）进行比对，鉴别关键挥发物。

1.4 数据统计

将GC-MS原始文件进行数据预处理及统计分析。对于全扫描取得的数据，首先使用OpenChrom Community Edition (Version 1.3.0)将原始文件转换为CDF格式，并对其进行过滤降噪，再利用解卷积功能对其进行色谱峰的鉴定与积分。

使用R语言XCMS软件包将已积分数据进行样本间色谱峰匹配、分组及保留时间校正与缺失峰填充，最终将得到的数据矩阵导出。使用SIMCA-P（Version 14.1，Umetrics AB，Sweden）进行多变量统计分析。应用PCA和PLS-DA构建数学模型。由于样本数量的局限，选择交叉验证（cross validation，CV）方法进行模型验证。通过参数的置换测试及方差交叉验证分析（CVANOVA）计算特征变量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）的不确定度，进一步评估模型的有效性及稳健性，并对VIP值进行排序。

2 结果与分析

2.1 样品GC-MS测定

图 1 3 种啤酒（A～C）及质量控制样品（D）的总离子色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of three beer samples and quality control sample

首先采用不解析化合物的方法[25]对样品中检出的组分进行筛选。如图1所示，样品间的总离子流图没有视觉可见的明显差异，很难通过传统的GC-MS定性定量分析迅速直观地确定其关键风味化合物。

将原始数据导入R语言XCMS软件包，进行色谱峰识别、过滤及对齐处理，同时设置相应参数[26]，并得到包括质荷比、保留时间及峰面积等信息在内的数据矩阵。本研究最终获得了1 751 个特征值，将其导出至Excel表格，再使用SIMCA-P 14.1软件进行PCA及PLS-DA，结合MetaboAnalyst软件筛选风味差异标志物，并进行后续统计分析。在此过程中原始数据通过预处理转化为标准化数据的最佳替代模型。数据标准化后消除变量间量纲关系，为所有变量提供相似的权重，导致质谱特征的响应被均一化，因此来自低强度信号与高强度信号的相关信息以相同比例被测量。

2.2 PCA结果

本研究并未对所有组分进行定性定量分析，而仅将不同样品间差异显著的组分进行鉴别。GC-MS扫描的24 批次样品，进行数据处理，最终将提取色谱峰响应值形成矩阵，并导入SIMCA-P 14.1进行PCA。

PCA用于初步筛查在全扫描模式下获得的质谱信息，原始数据经XCMS软件包进行峰识别、过滤、对齐等处理后导入SIMCA-P软件进行PCA，将Ctr模式处理过的数据进行拟合，得到所有提取特征值的得分图（图2）。拟合后的方程提取了4 个主成分，包含原始数据中累计的信息，说明拟合度较好，但模型被解释的总变量累计Q2=47.4%，这可能是受样品化学组分及其基质背景中高丰度化合物的影响，使主成分的响应贡献不明显，不同品牌啤酒的信息可视化结构差异不显著，结果导致分布在得分图中不同品牌的啤酒未能有效区分。

由图2可知，质量控制样品的重复样本间较为聚集，且位于得分图中心原点附近，说明本实验方法及仪器设备较稳定。此外，3 组样品中除了A品牌的2 个样品外，其他数据点都在95%的置信区间内，将上述偏离值剔除，并进一步进行PLS-DA。

图 2 全扫描模式下提取信息的主成分得分图Fig. 2 PCA score plot for extracted data in full scan mode

2.3 PLS-DA结果

图 3 PLS-DA得分图（a）与检验图（b～d）Fig. 3 PLS-DA score plot (a) and permutation test graphs (b-d)

表 2 PLS-DA模型参数Table 2 Parameters of PLS-DA model

PCA只能反映样品整体趋势，不利于发现组间差异及具体化合物特征，因此需要通过PLS-DA更为准确地进行数据分析，挖掘组间细微差异[27]。

为了选择需要识别的标记，建立有监督的PLS-DA模型，分类信息被纳入分析。用Ctr算法进行数据转换，样品的特征信息在PC1上被有效分离，其占总方差的46.7%。PC2累计显著性信息为73.2%，呈现的此类差异主要与样品的不同酿造工艺所产生的风味指纹有关，因此可完成根据给定样品特征的类别建模。与PCA相反PLS-DA以最大化分量获得的方差构建主成分，PLS-DA潜在变量用以解释样本的组间差异。PC1和PC2有效区分啤酒的类别，其分别解释了46.4%和52.5%的数据差异。如图3a所示，A样品较松散的位于图上方区域；而B样品紧凑分布在左侧区域；C样品分布于右下侧较宽的区域。B啤酒的数据集较A、C更为集中，说明此品牌啤酒的GC-MS特征指纹更加均匀分布，这一发现与A、C啤酒比B啤酒富含更多种类的风味化合物一致。

本模型交叉验证确认的22 个样本都被正确分配，没有假阳性或阴性的情况出现，具有良好的质量。PLSDA模型拟合方程参数见表2。其中Q2=0.844，均大于0.5，CV-ANOVA=1.430 6，且各参数间差异较小，说明拟合方程较为可靠。由图3a可知，样品组间有明显差异，组内各数据点相对较为聚集，表明样品间重复性好且较稳定。

当PLS-DA模型中的样本数远低于变量时，容易出现过拟合现象。为了评估模型性能，进行200 次置换检验，如图3b～d所示。其中所有的Q2点从左到右均低于最右端的原始Q2点，其回归线截距值分别为（0.302，-0.603）、（0.949，-0.118）、（0.323，-0.591），且Q2均小于0，说明该模型有效可靠[28]，未出现过拟合现象。

主成分得分图的几何分布仅给出了聚类趋势，未能直接用于区分啤酒类别。结果显示采用PLS-DA模型区分3 种品牌Lager啤酒间挥发物差异效果较理想。将模型中VIP值大于2，且P值小于0.05及倍数变化大于1.2的因子作为关键差异挥发物，如表3所示。

表 3 PLS-DA模型的关键化合物保留时间和m/z匹配Table 3 Retention time and m/z match of key compounds from PLS-DA model

2.4 RFC结果

RFC使用分类集合决策树的策略，对每棵决策树都通过从引导程序中随机选择特征产生每个样本分支，类预测基于整体投票的多数。在决策树构造期间，采用重复抽样技术从原始样本中抽取一定数量的样本，并根据其计算待估的统计量T，经过N次重复抽样，得到统计量T样本方差。

本研究选择A、B、C 3 种品牌Lager啤酒样品建立RFC模型，并与PLS-DA结果进行相互验证。图4表明误差率在400决策树时已变得稳定，“袋外”误差[29]使用给定参数误差为0，因此选择使用500决策树构建RF分类器。

图 4 随机森林分类的累计错误率Fig. 4 Cumulative error rates of RFC

RFC模型除了提供变量重要性的衡量指标外（通过测量“袋外”误差的增加评估其重要性），还可通过预测准确度评价标记物重要性。图5给出了本RFC模型排名前列的关键标记物（表4），其顺序按预测准确度降序排列，与PLS-DA选择的关键标记物（表3）相类似。

图 5 关键化合物重要特征平均精度排名Fig. 5 Average precision of important features of key compounds in increasing order

表 4 关键化合物标记特征平均精度排序Table 4 Key compounds listed in decreasing order of average accuracy of marker features

由表4可以看出，除十甲基环五硅氧烷是色谱柱流失及M174T2700、M159T2700因响应值太低无法定性外，其他关键性组分多为脂肪酸及其乙酯。

2.5 模型对比

选取3 种品牌Lager啤酒的不同生产批次样品分别建立PLS-DA及RFC模型，并对其进行分类预测，准确度均为100%，如表5所示。辛酸乙酯、癸酸乙酯等物质在上述2 个模型中对被研究样品分类均有积极贡献，同时验证了模型的有效性，可初步判断此类物质是区分本研究所选择的3 种Lager啤酒现阶段风味特征的关键指标。

表 5 RFC和PLS-DA模型对啤酒分类结果Table 5 Classification results of beer by RFC and PLS-DA models

3 结 论

利用感官品评结合GC、GC-MS对特定挥发性成分进行定量分析是传统啤酒风味研究的范式，它促进了人们对啤酒风味的理解，在一定程度上取得了成功，但由于其仅关注直接产生感官刺激的关键风味化合物，而忽略了其他潜在的具有调节风味活性的成分之间的相互作用，因此许多有用信息可能被忽略。本实验使用的非靶向风味组学与数据挖掘技术丰富了啤酒风味解析的手段，对类似的饮料及酒类的风味研究及产品真实性判别的方法研究也起到积极作用。随着分析仪器技术的进步可获得更多维度的数据，为揭示啤酒中复杂风味化合物之间的相互关系提供了更多手段，从而更好地理解整个啤酒酿造过程对风味造成的影响。

本研究通过HS-SPME-GC-MS技术对啤酒中挥发物进行表征、分类及多变量分析，证实了DVB/CAR/PDMS萃取纤维及室温5 min的萃取条件可适用于啤酒中挥发物的差异化研究，其中发现的部分关键风味物质在统计学上存在显著性差异。与之前对不同风格啤酒[23]差异化组学分析相比本实验进行相同品类啤酒风味区分的研究，虽然仅使用3 种特定品牌的Lager啤酒作为研究对象，但在一定程度上说明了不同酿造条件（如原料成分、糖化条件及发酵工艺等）可造成成品啤酒风味存在细微的差别。本方法也可设计针对每个工艺环节的特定样本集，包括原料品种、种植环境及酿造过程中可能对成品风味造成影响的因素。