石榴酒发酵过程中真菌种群演替及风味物质代谢规律解析

彭 潇，邹文静，邵清清，孙中贯，张立华，李贺贺，王雪山,*

（1.山东省石榴精深加工工程技术研究中心，山东省石榴资源综合开发工程实验室，枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

石榴（Punica granatum）是千屈菜科（Lythraceae）石榴属（PunicaL.）落叶果树，其饱含安石榴苷、花青苷和黄酮等多酚类抗氧化物质以及人体必需的微量元素，是古老的保健水果，被誉为超级水果[1]。石榴液态发酵酿酒的深加工方式保留了石榴鲜果自然风味和营养成分的同时，增加了其抗氧化活性，是一种极具食疗保健作用的果酒，有助于提升其经济和实用价值。因此，近年来石榴酒成为国内外均颇为流行的新型果酒[2-3]。石榴酒的发酵工艺通常参考葡萄酒的发酵工艺，在采摘、运输、破碎及榨汁等环节会带入石榴表皮及环境中的多种酵母、霉菌及细菌等多种微生物都会进入石榴酒发酵过程中[4-5]。这些微生物在发酵过程中产生多种代谢物质，影响石榴酒的风味、安全及产品质量稳定性。然而目前国内外对石榴酒发酵过程中微生物的种群演替规律及其代谢特征均不清晰。

目前国内外关于石榴酒的研究主要在研究其发酵工艺及风味等方面，如张宝善等[5]优化了通过葡萄酒酵母发酵甜石榴及酸石榴的发酵工艺，发现发酵温度越高，发酵期越短，酒度越低，甲醇和杂醇油含量越高，并获得了生产石榴发酵酒的适宜加工工艺和参数。兰永丽[4]表明石榴酒发酵前后风味物质图谱发生极大改变，其中石榴酒风味物质成分主要由醇类和酯类组成，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和3-甲基-1-丁酸酯含量最高，同时发现发酵过程中柠檬酸、草酸、苹果酸、酒石酸和乳酸是其中最主要的有机酸。Andreu等[6]通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法比较石榴汁和石榴酒中风味物质组分，发现辛酸乙酯是石榴酒中最主要的挥发性物质，同时发现乙酸苯乙酯、苯乙醇等14 种化合物仅在发酵后的石榴酒中检测到。而目前国内外关于石榴酒酿造微生物的研究则多数通过可培养方法进行石榴酒酿酒酵母的分离、选育，或比较不同酿酒酵母进行石榴酒发酵的性能。如刘玉琼等[7]以石榴树叶、石榴皮及石榴园土壤为分离源，选育新疆石榴酒专用酵母。Berenguer等[8]比较3 株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵石榴酒的性能，发现S. cerevisiaevar.bayanus能够在营养缺乏条件下进行发酵。这些研究极大的推进了石榴酒发酵工艺的优化，但是目前国内外鲜见关于石榴酒发酵过程中土著微生物的研究，因此目前亟需解析石榴酒发酵过程中参与的微生物以及这些微生物在发酵过程中发挥的作用。

近年来，高通量测序已经广泛的应用到肠道[9-10]、食品[11-13]等多种领域微生物的研究中，是研究发酵食品微生物的有力工具。本研究结合高通量测序及GC-MS解析石榴酒发酵过程中土著微生物种群演替规律及其对石榴酒风味成分的贡献，以期为石榴酒发酵工艺优化、提升产品品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴采购自山东省枣庄市峄城区。

焦亚硫酸钾 法国Sofralab公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；L-薄荷醇 德国Sigma-Aldrich公司；土壤基因组提取试剂盒 美国Omega Bio-tek公司。

1.2 仪器与设备

手持糖度计 北京亚欧德鹏科技有限公司；智能恒温恒湿培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；高速冷冻离心机 德国Sigma-Aldrich公司；6890-5975 GC-MS仪美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴酒发酵及样品采集

将石榴对半剖开，戴手套剔除隔膜及石榴皮，去除霉烂籽粒和隔膜；将去皮后的籽粒加入压榨机中进行压榨得到石榴汁，将石榴汁经无菌纱布过滤后备用。将2 L石榴汁加入3 L除菌玻璃发酵罐中，同时向石榴汁中加入60 mg/L的焦亚硫酸钾，糖度调整至20 °Bx；然后将发酵罐置于22 ℃恒温培养箱中发酵8 d，将发酵罐转移至10 ℃培养箱中发酵17 d。

发酵第0、4、8、15、25天时从每个发酵罐中取50 mL石榴汁样品，共设置3 个发酵罐作为平行对照，共取样品15 份。

1.3.2 基因组提取及高通量测序

将10 mL石榴汁样品于13 000×g离心后收集菌体，用无菌1 倍PBS溶液洗涤菌体1 次，然后将菌体按照土壤基因组提取试剂盒说明书进行宏基因组提取。将提取合格的DNA送北京奥维森基因科技有限公司进行高通量测序。选择ITS3和ITS4引物扩增真菌ITS2区，测序平台为MiSeq 300 bp双端测序。测序原始数据下机后质控及数据处理参考文献[14]。

1.3.3 挥发性化合物检测

取8 mL发酵液加入顶空瓶（20 mL，预先加入3 g NaCl）中，加入20 μLL-薄荷醇（100 μg/mL）为内标，采用内标法检测挥发性化合物的含量。挥发性物质采用GC-MS检测，检测条件参考文献[15]方法。

1.4 统计分析

挥发性化合物半定量浓度数据通过ln（n+1）方式进行标准化处理。样品真菌种群α多样性指数利用Qiime将测序数据抽平至42 372读数后计算；不同样品多样性差异显著分析采用SPSS中t-test进行分析；不同样品中风味物质主成分分析（principal component analysis，PCA）及微生物非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）均采用R v.3.3.1（http://www.r-project.org）中Vegan程序包实现；不同微生物种群与代谢物之间时间相关性网络利用Eviews v.10.0中Granger因果关系算法计算[16]，并通过Gephi v.0.9.1实现网络关系的可视化[17]。

2 结果与分析

2.1 石榴酒发酵过程中风味物质变化规律

表 1 石榴酒发酵过程中挥发性化合物Table 1 Volatile organic compounds detected during pomegranate wine fermentation

续表1

通过GC-MS从15 个石榴发酵液样品中共检测到65 种挥发性化合物，包含11 种醇类、6 种酸类、28 种酯类、13 种芳香族物质、4 种酮类和3 种含硫化合物（表1和图1）。PCA显示石榴酒中风味物质随着发酵时间呈现明显的变化（图2）。PC1可解释发酵过程中风味物质变化的60%，发酵前4 d在其中起主要作用。PC2仅解释风味成分变化的12.3%，主要由发酵4～25 d引起。这表明发酵前4 d是石榴酒中风味物质形成的最关键时期。

图3显示未发酵的石榴汁中共检测到40 种物质，主要包含乙酸异戊酯（348.34 μg/L）、乙酸乙酯（576.53 μg/L）及乙酸苯乙酯（209.43 μg/L）等物质。其中乙酸乙酯（菠萝香、苹果香、水果香）也是Mollar de Elche石榴汁中的主要风味物质，但是乙酸异戊酯（香蕉香、甜香、苹果香、水果糖香）及乙酸苯乙酯（玫瑰花香、花香）在Mollar de Elche石榴汁中含量很低[6]。这可能是因为石榴品种差异导致其中风味物质含量不同。然而随着发酵过程的进行，正己醇、3-己烯-1-醇、乙酸异戊酯等物质含量逐渐降低，其中蘑菇醇、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、2,3-戊二酮、烯丙基甲基硫醚等12 种物质仅能在未发酵石榴汁中能检测到（图1、3）。而异戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等物质含量随着发酵时间增加。

图 1 石榴酒发酵过程中挥发性化合物含量变化Fig. 1 Changes in volatile organic compounds during pomegranate wine fermentation

发酵结束时，石榴酒样品中共检测到53 种挥发性化合物，其中异丁醇、草酸、月桂酸乙酯、癸酸异戊酯、乙烯基1-丁硫醚等25 种物质仅在发酵结束的石榴酒中能检测到（图1、3）。这个现象与前人研究一致，同样认为辛酸乙酯（梨子香、荔枝香、水果香、甜香、百合花香）、癸酸乙酯（菠萝香、水果香、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、花香）及苯乙醇（玫瑰花香、月季花香、花香、花粉香）等是石榴酒中的主要风味物质[4,6]。这表明，发酵过程可以增加石榴酒风味成分及风味特征的多样性，对石榴酒的风味特征形成起到至关重要的作用。

图 2 石榴酒发酵过程中风味物质PCAFig. 2 PCA plot of volatile organic compounds during pomegranate wine fermentation

图 3 石榴酒发酵前后挥发性化合物种类Venn分析Fig. 3 Venn diagram showing unique and shared volatile organic compounds in pomegranate juice and wine

2.2 石榴酒发酵过程中真菌种群演替规律

通过高通量测序检测石榴酒发酵样品，共检测到1 006 014 条高质量序列，平均每个样品67 068 条序列，其中序列最少的样品含有42 372 条序列。稀释曲线（图4）显示，在42 372 条序列水平下，每个样品曲线都趋于平稳，说明此测序深度能够满足分析石榴酒真菌种群的需要。

图 4 石榴酒发酵过程中真菌种群测序稀释曲线Fig. 4 Rarefaction curves from fungal community sequencing during pomegranate wine fermentation

多样性指数分析发现，随着发酵的进行，石榴酒中真菌种群多样性呈现先降低，后升高的现象（表2）。其中发酵第4、8天时，样品的Shannon指数、Simpson指数均显著低于未发酵时，而在发酵第15天后，样品真菌种群多样性呈回升趋势。NMDS分析显示石榴酒的发酵过程中可分为3 个阶段，结果显示0～4 d是真菌种群结构变化最主要的阶段，而4～8 d真菌种群结构比较接近，发酵8 d之后种群结构的变化，可能由于发酵温度调整为10 ℃，微生物种群结构发生了应激调整（图5）。

表 2 石榴酒发酵过程中真菌种群多样性变化Table 2 Diversity indexes of fungal communities during pomegranate wine fermentation

图 5 石榴酒发酵过程中真菌种群NMDSFig. 5 NMDS analysis of fungal communities during pomegranate wine fermentation

所有样品中共检测到58 个真菌属，其中酵母属（Saccharomyces）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）及曲霉菌属（Aspergillus）在所有样品中平均相对丰度大于1%，是石榴酒发酵过程中的优势真菌种群（图6）。有孢汉逊酵母属是石榴汁中的主要酵母种群，占总真菌种群相对丰度的57.84%～60.13%，其次是酵母属（7.02%～8.62%）、毕赤酵母属（4.48%～6.37%）及假丝酵母属（1.64%～1.94%）。以往研究曾在石榴皮、腐烂的石榴果实及石榴加工设备等区域检测到这些菌株，说明石榴汁中的这些酵母及霉菌可能来自于石榴采集及加工过程中接触到的这些环境[18-20]。发酵第4天时，发酵液中酵母属相对丰度增加至94.17%～97.26%，其中最主要的OTU是酿酒酵母，其他非酿酒酵母及霉菌的相对丰度则显著降低。这可能是3 个原因导致的，一是酿酒酵母与其他微生物形成营养竞争，而酿酒酵母对营养的利用能力更强[21]；二是发酵过程中酿酒酵母代谢产生大量乙醇，而酿酒酵母比其他微生物对乙醇的耐受性更高[21]；三是酿酒酵母可分泌产生一种多肽抑制非酿酒酵母的生长[22]。同时，4～8 d时酿酒酵母是发酵体系中绝对优势菌种，其主要作用是产生乙醇，说明这一时期也是发酵过程中产醇的主要阶段。发酵8 d之后，酿酒酵母相对丰度降低，非酿酒酵母相对丰度升高，这可能是由于8 d之后发酵温度降为10 ℃。以往关于葡萄酒的研究表明，有孢汉逊酵母、毕赤酵母及假丝酵母等非酿酒酵母可代谢产生多种芳香族物质及单萜类物质，可增加葡萄酒的水果香气[23]。而石榴酒发酵这一阶段中这些非酿酒酵母丰度的增加同样可能是石榴酒中芳香族化合物等风味物质增加的主要原因（图1），这同时也表明适度的低温发酵有利于非酿酒酵母繁殖，有利于增加石榴酒的风味多样性。

图 6 石榴酒发酵过程中真菌种群演替Fig. 6 Fungal community succession during pomegranate wine fermentation

2.3 石榴酒发酵过程中真菌种群与风味化合物之间相关性分析

为了进一步研究发酵过程中真菌种群对石榴酒风味成分的贡献，本研究应用Granger因果关系法分析了主要真菌种群与风味物质之间的时间相关性。Granger因果关系是经济学领域中的一种重要方法，可以利用时序性数据分析其中因果关系[24]。与Pearson相关性、Spearman相关性等分析不同的是，Granger因果分析具有方向性，因此近年来Granger因果关系逐渐被用于肠道微生态、水体微生态等研究中[16,25-26]。

石榴酒发酵过程中真菌种群是风味物质的主要来源之一。异丁醇和异戊醇是石榴酒中主要的高级醇类物质，又称为杂醇油。一定量的高级醇可以增加酒的醇厚感，但是含量过高则会导致酒容易上头。Chen等[27]研究表明，葡萄酒发酵过程中酿酒酵母会代谢产生大量异丁醇和异戊醇等高级醇。发酵过程中，酿酒酵母可以代谢亮氨酸等支链氨基酸产生异丁醇及异戊醇[28-29]。图7表明，酿酒酵母与假丝酵母均与异丁醇和异戊醇呈现Granger因果关系。因此，本研究中异丁醇和异戊醇在发酵中后期大量产生，可能主要是由酿酒酵母代谢石榴汁中支链氨基酸产生的。乙酸乙酯及月桂酸乙酯是石榴酒中的主要酯类物质，可以增加石榴酒的水果香及花香。Chen Jia等[30]研究显示，山西陈醋中筛选出的毕赤酵母可以代谢产生乙酸乙酯、月桂酸乙酯等多种酯类物质。同时，图7显示酿酒酵母、有孢汉逊酵母、毕赤酵母及假丝酵母对这两种酯类均呈Granger因果关系。因此，推测石榴酒中乙酸乙酯及月桂酸乙酯代谢可能也与毕赤酵母有关。此外，图7显示发酵过程中的草酸、异丁酸、辛酸等酸类物质同样对发酵体系中的酵母种群有一定作用。

图 7 真菌种群与挥发性风味化合物Granger因果关系分析Fig. 7 Granger causality between fungal communities and volatile flavor compounds

3 结 论

本研究应用高通量测序系统解析了石榴酒发酵过程中真菌种群演替规律，发现酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属及曲霉菌属是石榴酒发酵过程中的优势真菌种群。结合代谢组学及统计学手段表明这些微生物对石榴酒中异丁醇、异戊醇等高级醇类，乙酸乙酯、月桂酸乙酯等酯类物质有较强贡献。本研究为深入挖掘石榴酒功能微生物，提高石榴酒产品质量及稳定性提供理论基础。