实时定量聚合酶链反应在t（8；21）急性髓系白血病移植中的应用

薛慧，胡永超，王娜，刘志彬，高峰

（华北理工大学附属医院血液科，河北 唐山 063000）

实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）技术因其高度敏感性及特异性，已经成为微小残留病（minimal residual disease，MRD）检测的重要手段［1］，其对基因标志物的检测不仅限于定性分析，而且可以定量分析，为临床治疗提供了重要依据。本研究选取28例行移植治疗的初诊为t（8；21）急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者（均为高危病例）为研究对象，应用RQ-PCR技术检测AML1-ETO基因水平，以此代表MRD，指导移植前后治疗方案。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月至2018年12月于我院行移植治疗且初诊为t（8；21）的AML患者28例。其中，男17例，女11例，中位年龄37（14～57）岁。骨髓形态学、分子生物学及细胞遗传学均符合确诊标准［2］，且融合基因分析为AML1-ETO阳性，不伴其他基因突变及染色体异常。

1.2 移植前治疗

给予标准的柔红霉素/去甲氧柔红霉素/阿克拉霉素+阿糖胞苷诱导治疗，经1～2个疗程获得血液学完全缓解后，给予包含中大剂量阿糖胞苷的巩固治疗。

1.3 RQ-PCR技术指导高危病例选择

应用RQ-PCR技术，将骨髓血作为标本，以初诊时AML1-ETO基因水平为基线，高危病例选择标准为2疗程巩固治疗后AML1-ETO基因水平比初诊时下降＜3个对数级或者AML1-ETO基因阴性后再次转阳。

28例研究对象均符合高危病例，随机分为2组：自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT）组8例，其中，男5例，女3例，中位年龄40（21～57）岁，均给予改良白消安/环磷酰胺（北京大学人民医院方案）参考方案［3］。异基因外周血造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）组20例，其中，男12例，女8例，中位年龄32（14～56）岁。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）全相合6例，HLA半相合14例，造血干细胞来源为亲缘供者的外周血，均给予改良白消安/环磷酰胺±兔抗人免疫球蛋白参考方案［3］。

1.4 AML1-ETO基因水平的检测方法

1.4.1 提取标本RNA：收集患者肝素抗凝的骨髓血2～3 mL，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，按照Trizol试剂说明的操作流程，提取细胞总RNA，紫外线分光光度计（260 nm）检测RNA的浓度，置于-80℃冰箱保存。

1.4.2 RNA逆转录：将样本RNA稀释到合适浓度，抽取10 μL加入PCR反应管（内含逆转录试剂），震荡混匀，短暂离心，设置PCR反应程序，将制备的cDNA置于-20 ℃冰箱备用。

1.4.3 反应体系：使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪，反应体系为10 μL，cDNA 1 μL，TaqMan探针0.2 mol/L，上下游引物各0.1 μmol/L。以ABL1基因为内参对照，测定AML1-ETO基因与内参ABL1基因的拷贝数比值，以百分数的形式表示，即AML1-ETO/ABL1（%）=（AML1-ETO拷贝数/ABL1拷贝数）×100%。

1.5 MRD监测时机

初诊时，巩固化疗周期结束血象恢复后，移植后1、2、3、6、9、12、18、24和36个月，常规抽取骨髓血做标本，如果出现AML1-ETO基因转阳或水平升高，半月后复查，如持续升高则给予干预或治疗，如治疗后连续2次AML1-ETO基因转阴，则恢复常规频率的检测。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，率的比较用χ2检验，Kaplan-Meier生存曲线计算疾病无进展生存率（free survival rate，PFS）及总生存率（total survival rate，OS）。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植后RQ-PCR技术指导下的干预治疗

所有研究对象定期检测骨髓血MRD水平，以MRD≥0.01%作为干预治疗临界值；移植后MRD转阴指移植后+1月骨髓血MRD定量为0。AHSCT组中，3例移植后MRD持续阴性患者，未行干预治疗；4例移植后MRD持续阳性、1例移植后MRD由阴性再次转为阳性患者，给予含中大剂量阿糖胞苷的常规化疗。Allo-HSCT组中，13例移植后MRD持续阴性患者，未行干预治疗；4例移植后MRD持续阳性患者，早期给予减停免疫抑制剂、化疗+预防性供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion，DLI）（亲缘供者经重组人粒细胞刺激因子动员的外周血干细胞输注）；3例移植后MRD由阴性再次转为阳性患者中，2例给予减停免疫抑制剂，1例3年后髓外复发患者，给予放化疗治疗。

2.2 移植后MRD水平与复发的关系

移植后根据MRD是否转阴分为2组：MRD转阴组共20例患者，其中，2例患者最终血液学复发，复发率为10.0%（2/20）；MRD持续阳性组共8例患者，其中6例患者最终血液学复发，复发率为75.0%（6/8）。2组比较，移植后MRD转阴组的血液学复发率明显低于MRD持续阳性组（P=0.002）。

2.3 Allo-HSCT组移植后血液学复发的单因素分析

外周血Allo-HSCT后血液学复发与HLA配型、移植后移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）的发生无明显相关性；与移植后MRD是否转阴有明显相关性，MRD未转阴患者有更高的血液学复发率。见表1。

2.4 临床疗效

表1 Allo-HSCT组血液学复发单因素分析

本研究中位随访时间为29（10～78）个月，随访时间截至2019年12月。AHSCT组中，3例移植后MRD持续阴性患者均无病生存；5例移植后MRD阳性（包括再次转阳）患者中，3例死亡，2例带病生存；本组3年PFS、OS分别为50.0%和72.9%，5年PFS、OS分别为33.3%和48.6%。Allo-HSCT组中，13例移植后MRD持续阴性患者均无病生存；7例移植后MRD阳性（包括再次转阳）患者中，4例死亡，2例带病生存，1例早期减停免疫抑制剂后MRD再次转阴无病生存；本组3年PFS、OS分别为72.4%和84.4%，5年PFS、OS分别为64.4%和75.0%。

3 讨论

t（8；21）（q22；q22）是AML-M2中最常见的重现性染色体易位，对应其改变的AML1-ETO基因［4］在白血病发生发展中起到了重要作用。主鸿鹄等［5］建议进行疾病的分层治疗，高危复发因素包括治疗前c-KIT突变、巩固治疗2疗程MRD下降＜3个对数级、MRD再次转阳，符合以上任意1项危险因素的患者均建议行Allo-HSCT，以降低复发、提高长期生存率。本研究选取28例高危t（8；21）AML患者为研究对象，经包括中大剂量阿糖胞苷在内的巩固治疗，随机选择不同的移植治疗，结果显示，Allo-HSCT组3年、5年PFS、OS明显优于AHSCT，提示有高危复发风险的患者更适宜选择Allo-HSCT，AHSCT可以做为一个巩固强化的手段改善预后，但不能明显改善患者的长期生存。

本研究中，应用RQ-PCR技术监测MRD水平，在移植前筛选高危病例进行移植治疗，移植后预防疾病复发、指导治疗方案选择。尤其在Allo-PBSC组移植后的指导方案如下：MRD持续阴性，给予常规检测、定期随访；MRD持续阳性，快速减停免疫抑制剂，给予预防性DLI+化疗［6-7］；MRD由阴性再次转阳，首先考虑减停免疫抑制剂［8］，视情况给予预防性DLI±化疗。结果显示，7例移植后MRD阳性（包括再次转阳）患者在血液学复发前给予早期干预，随访至今仅4例复发死亡，提示在分子学复发或未缓解情况下，早期干预治疗可降低血液学复发率，延长患者生存期。

随访至终点时间，血液学复发患者均临床死亡，建议对复发的高危患者及早进行干预治疗，而移植后MRD水平在预测疾病复发中也起到了重要的预测作用［9-10］。本研究结果显示，移植后+1月MRD转阴组的血液学复发率明显低于MRD持续阳性组（P＜ 0.05）；同时，进一步分析了Allo-HSCT组移植后血液学复发的危险因素，结果显示，移植后+1月MRD未转阴患者有更高的血液学复发率。

综上所述，在t（8；21）AML患者治疗过程中，应用RQ-PCR技术动态检测MRD水平，为治疗提供了理论基础和临床依据，值得进一步深入研究。