基于长QT综合征的钙调蛋白突变体CaMD130G与心肌钠通道NaV1.5 IQ基序的结合作用

张晓琳，邵秀丽，朱荣利，张瑞佳，郝丽英，封瑞

（中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122）

长QT综合征（long QT syndrome，LQTs）是一种心律失常综合征，心电图检查具有QT间期延长、T波或U波异常等表征，临床易产生恶性心律失常［1-2］。LQTs不仅患病率较高，猝死率也很高［3］。目前，研究［4-5］已经明确LQTs与某些离子通道有关，例如L型钙通道，钠通道和钾通道。此外，许多调节通道的蛋白也被证实与LQTs的发生相关，如钙调蛋白（calmodulin，CaM）［6-8］。

心肌细胞上主要表达的钠通道为NaV1.5通道，由1个α亚基和1个或多个β亚基组成。心肌NaV1.5受细胞内CaM等多种细胞因子的调节［9-12］。CaM某些位点发生突变，导致NaV1.5的调节异常，最终可引发心脏疾病［13］。本课题组早期的研究已经成功制备出CaMD130G（第130位天冬氨酸突变为甘氨酸）突变体蛋白，但其在LQTs发病过程中与心肌NaV1.5通道的结合及调节作用仍然未知。

本研究拟采用同源建模和分子对接的方法对CaM、CaMD130G与心肌NaV1.5通道IQ基序对接，初步探索结合可能性。同时拟构建、表达、制备与纯化IQ蛋白，并初步探索其与CaMD130G的结合活性，为相关疾病的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-6P-1/GST-IQ质粒由北京擎科新业生物技术有限公司合成；胰蛋白胨和酵母提取物购自美国Oxid公司；异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、氨苄西林（ampicillin，Amp）、溶菌酶（lysozyme，Lys）以及N-月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine sodium，N-lau）均购自美国Sigma公司；Triton X-100和磷酸盐缓冲液（phosphate bufer，PBS）粉末购自北京Solarbio公司；Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）购自英国GE Healthcare 公司。

1.2 同源建模与蛋白对接

获得心肌NaV1.5通道IQ基序和CaM及其突变体CaMD130G氨基酸序列（图1），采用SWISS MODEL 数据库进行同源建模与分子对接。通过PyMOL软件读取，修饰并分析对接结果。

1.3 融合蛋白GST-IQ的制备

图1 心肌NaV1.5通道及CaMD130G的模式图Fig.1 Schematic diagram of the cardiac NaV1.5 channel and CaMD130G

1.3.1 诱导与表达：将重组pGEX-6P-1/GST-IQ质粒转化入大肠杆菌感受态细胞并放于含有Amp的1×LB培养液中进行培养，在90 r/min、37 ℃水浴的条件中振荡培养12～16 h。当光密度（optical density，OD）600处于0.6～1.2时向培养基中加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），37 ℃、110 r/min 振荡4 h，以诱导重组蛋白的表达。

1.3.2 蛋白提取：收集诱导表达重组IQ蛋白的菌液，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀。向其中加入PBS缓冲液重悬沉淀，依次加入20 mg/mL Lys（终浓度为0.1 mg/mL）、N-Lau（终浓度为1.5%）和1 mol/L DTT（终浓度为5 mmol/L）并混匀，于冰上静置30 min。然后于冰上超声破碎30 min，加入30%TritonX-100至1%混匀后再次静置30 min，此后得到的细菌裂解液放入4 ℃恒温离心机中15 000g高速离心10 min，得到IQ蛋白粗提液。

1.4 Pull-down结合实验

在15 mL EP管中用PBS清洗GS-4B beads 3次（每次800 r/min，3 min离心），将提取的IQ蛋白加入到洗好的beads中，于4 ℃条件下过夜孵育。次日，用Tris buffer清洗3次，获得GST-IQ蛋白。在2 mL EP管中加入GST-IQ蛋白40 μL，再依次加入相应浓度的CaM/CaMD130G，使终浓度分别为2.1，3.5，7.0，10.0 μmol/L，然后向其中加入CaCl2至钙离子（Ca2+）终浓度为10 μmol/L，再加入Tris Buffer至300 μL，然后于4 ℃的条件中缓慢旋转孵育4 h。孵育后，清洗2遍。最后加入loading buffer，煮沸5 min，将获得的结合蛋白进行15% SDS-PAGE电泳。

2 结果

2.1 CaMD130G蛋白与心肌NaV1.5通道IQ的同源建模与蛋白对接

在SWISS-MODEL网站中对心肌NaV1.5通道的IQ蛋白、CaM及其突变体CaMD130G蛋白成功建模，其中IQ蛋白和CaM的模型与目标序列完全一致，同源性高达100%。而CaMD130G因为第130位点突变，只有1个氨基酸序列发生变化，所以模型同源性为99.45%。虽然CaMD130G在建模时空间结构与CaM一致，但其结合Ca2+的数量减少。本研究结果显示，正常CaM结合4个Ca2+，但突变体CaMD130G只结合3个Ca2+，在靠近C末端第130位氨基酸位点处丢失了1个Ca2+的结合。同时，研究发现无论是CaM还是CaMD130G在蛋白对接中都能与IQ 蛋白对接上，预测CaMD130G可与心肌NaV1.5有结合活性。见图2。

2.2 重组心肌NaV1.5通道IQ质粒和蛋白的制备

图2 CaM/CaMD130G-IQ蛋白对接图Fig.2 CaM/CaMD130G-IQ protein docking diagram

质粒载体pGEX-6P-1碱基长约4 900 bp，酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ之间的碱基全长约20 bp，IQ的碱基序列大小为135 bp，经3’端和5’端双酶切并插入IQ基因后整个重组质粒pGEX-6P-1/IQ全长约5 015 bp。重组质粒EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切后获得1个大分子量DNA（约为3 100 bp）和1个小分子量DNA（约为1 900 bp）。琼脂糖凝胶电泳（图3A）结果显示，泳道1中约5 000 bp处的条带是重组质粒pGEX-6P-1/IQ的碱基大小。泳道2中3 100 bp和2 900 bp处均可看到明显的条带，质粒制备结果与理论值一致，证明心肌NaV1.5通道IQ质粒构建成功。将质粒转化入大肠杆菌，再由IPTG诱导IQ蛋白的表达，采用超声破碎法提取IQ蛋白并进行15% SDS-PAGE电泳，得到纯度和浓度较高的IQ蛋白片段，见图3B。

2.3 心肌NaV1.5通道IQ蛋白与CaMD130G结合作用的鉴定

图3 重组心肌NaV1.5通道IQ质粒与蛋白制备Fig.3 Recombinant cardiac NaV1.5 channel IQ plasmid and protein

图4 CaM及CaMD130G与GST-IQ结合的SDS-PAGE电泳图Fig.4 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis of the binding between CaM/CaMD130Gand GST-IQ

Pull-down结合实验结果显示，在10.0 μmol/L Ca2+情况下，CaM和CaMD130G与心肌NaV1.5通道IQ蛋白均能结合，并且这种结合作用具有CaM和CaMD130G浓度依赖性，证明CaM和CaMD130G与心肌NaV1.5通道IQ蛋白具有很好的结合活性，见图4。

3 讨论

CaM作为一类胞内高度保守的Ca2+结合蛋白，不仅参与体内多种信号传导，在Ca2+依赖性的信号转导途径中更是起着至关重要的作用。Ca2+对CaM具有重要的调节作用，CaM对Ca2+具有依赖性，是动态多功能Ca2+传感器［14］。CaM有2个球型末端，每个末端含有2个Ca2+结构域，每个结构域能结合1个Ca2+，因此，每个CaM可以结合4个Ca2+。当CaM与Ca2+结合后自身构象发生改变，从而与目标蛋白结合，调控靶蛋白的活性使其发挥相应的生物学功能［15］。最近的研究［16-18］发现CaM基因的某些位点突变在多种心血管系统疾病中扮演着重要角色，严重威胁人类生命健康。

NaV1.5通道由SCN5A基因编码，结构复杂，是决定心肌细胞兴奋的关键因素，主要参与动作电位上升支形成和电冲动在心肌细胞间的传导。研究［10，16，19］报道，CaM主要与NaV1.5通道的IQ基序相互作用，从而对通道功能进行调节。CaM某些位点发生突变，破坏了NaV1.5失活状态的电压依赖性和稳定性，导致钠电流异常，引起LQTs等疾病，可导致心脏骤停甚至出现心源性猝死等不良事件。目前，与LQTs有关的CaM的多个突变位点已经被报道，如CaMD96V、CaME141G和CaMD130G等。有研究［20］证明CaME141G对心肌NaV1.5的调节的影响在LQTs中发挥重要作用。而对于CaMD130G与心肌NaV1.5的相互作用研究较少，探寻CaMD130G与心肌NaV1.5的结合作用对于研究LQTs等心脏疾病具有重要意义。本研究采用同源建模的方法对CaMD130G突变体进行建模，结果显示，CaMD130G模型可能因为第130位氨基酸突变导致结合的Ca2+减少了1个，此结果提示该位点的突变可能会影响CaMD130G的Ca2+依赖性，改变CaMD130G对Ca2+的亲和力，推测CaMD130G对心肌NaV1.5通道IQ基序的调节作用发生改变，最终可能导致LQTs等心脏疾病的发生。

以往研究［20］提示CaM与Ca2+结合特性的变化可能是CaM突变体引发LQTs的病理机制之一。本研究结果证明CaMD130G与心肌NaV1.5的IQ基序具有很好的结合活性，但是对其结合的Ca2+浓度依赖性和CaM浓度依赖性还不了解，需要进一步的实验明确其详细的结合模式，从而深入探讨LQTs发病可能的详细分子机制。本研究初步探索了CaMD130G与心肌NaV1.5的IQ的相互结合作用，为未来的深入研究奠定了坚实的基础，并为探讨LQTs的病理机制提供理论依据。