敲减SNORA31抑制胶质瘤干细胞血管生成拟态的作用机制
2021-03-31刘啸白王迪刘云会
刘啸白,王迪,刘云会
(中国医科大学附属盛京医院神经外科,沈阳 110004)
脑胶质瘤是最常见的原发性神经系统恶性肿瘤,约占原发性颅内恶性肿瘤的70%,5年生存率仅5%[1-2]。胶质瘤是典型的血管依赖性实体肿瘤,其丰富的血液供应是胶质瘤浸润性生长和转移的基础[3]。随着肿瘤血管新生研究的深入,贝伐单抗作为有效的抗血管生成药物,在胶质瘤治疗中显示出显著的短期疗效,但长期疗效不佳[4]。因此,深入研究调控胶质瘤血管生成机制具有重要的理论与应用价值。
胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞。最近的研究[5]表明GSCs能够形成血管生成拟态。血管生成拟态是独立于微血管内皮细胞构成的微血管系统,针对GSCs血管生成拟态的分子靶向治疗成为胶质瘤治疗研究的热点。核仁小RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)主要分布于真核生物细胞核仁,具有多种生物学功能[6]。促红细胞生成素肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2,EphA2)是促进血管生成拟态形成的重要因子,它通过调控细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)激活磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3’-OH kinase,PI3K),进而调控血管生成拟态的形成[7]。本研究拟探讨SNORA31抑制GSCs血管生成拟态的作用机制。
1 材料与方法
1.1 GSCs的培养与鉴定
参考奚卓等[8]的研究方法,采用中国医科大学附属盛京医院神经外科胶质母细胞瘤患者术中切除的肿瘤组织,PBS缓冲液洗涤肿瘤组织、剪碎,DMEM/F-12培养液培养获得胶质母细胞瘤细胞。胰蛋白酶对培养的细胞进行消化,收集细胞,并使用GSCs培养液 [含2% B27,10 ng/mL 碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),10 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)]重悬,培养并获得GSCs。本实验已获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。患者术前已签署知情同意书。
1.2 敲减SNORA31的质粒转染
构建敲减SNORA31(sh-SNORA31)质粒及其非靶向结合序列(sh-NC,阴性对照)质粒(中国GenePharma公司)。使用Lipo3000转染试剂混合将质粒分别在GSCs中转染。进一步通过梯度加入0.2 mg/mL G418(加药1次/24 h,最高至2 mg/mL)筛选出稳定转染的GSCs细胞,应用qRT-PCR方法检测SNORA31的表达,明确转染效率。
1.3 Western blotting检测
PBS缓冲液清洗GSCs 3次,使用RIPA裂解缓冲液从GSCs中提取蛋白。进一步通过电泳(恒压80 V)以及转印(恒流120 mA)将蛋白转印至PVDF膜。使用5%脱脂牛奶在室温封闭2 h,然后与相应一抗4 ℃条件下孵育过夜,具体如下:EphA2(1 ∶500,美国Santa Cruz Biotechnology公司)、ERK 1/2(1 ∶1 000,美国Santa Cruz Biotechnology公司)、p-ERK 1/2(1 ∶500,美国Santa Cruz Biotechnology公司)、p-PI3K(1 ∶500,美国Santa Cruz Biotechnology公司)、PI3K(1 ∶1 000,美国Santa Cruz Biotechnology公司)、GAPDH(1 ∶10 000,中国Proteintech公司)。第2天TTBS将膜洗涤3次,每次5 min,然后与相应二抗常温条件下孵育2 h,具体如下:山羊抗兔(1 ∶10 000,中国Proteintech公司)或山羊抗小鼠(1 ∶10 000,中国Proteintech公司)。TTBS将膜洗涤3次,每次5 min。最后应用ChemImager 5500软件进行扫描,使用发光试剂盒观察免疫印迹,使用灰度分析软件检测并计算相对灰度值(integrated density values,IDV)。
1.4 GSCs增殖能力检测
将收集的GSCs按照3×103/孔接种于96孔板,细胞恒温培养箱中培养48 h。然后在各组对应的孔中加入10 μL CCK8溶液,继续在细胞恒温培养箱中孵育2 h。最后使用SpectraMax M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)测量450 nm处的吸光度来检测GSCs的细胞增殖能力。
1.5 GSCs迁移和侵袭能力检测
应用Transwell方法检测细胞的迁移和侵袭能力。将收集的GSCs按1×105/mL悬浮于200 μL无血清培养基中,接种于上室(不含Matrigel基质胶,用于细胞迁移能力检测)或接种于预先涂有Matrigel基质胶的上室(含Matrigel基质胶,用于细胞侵袭能力检测)中,同时将配制含10%胎牛血清的GSCs培养基添加到下室,分别进行细胞迁移、侵袭能力的检测分析。细胞培养箱中培养24 h后取出小室并用甲醇和冰醋酸(3 ∶1)对膜表面细胞进行固定(30 min)。进一步使用10% Giemsa染色液在室温避光条件下染色4 h以上。最后在显微镜下统计并拍照(选择5个随机视野计数细胞数)。
1.6 基质胶三维管形成实验
应用基质胶三维管形成实验检测细胞的血管生成拟态能力。将收集的GSCs按60×104/mL悬浮于100 μL无血清培养基中,接种于铺有100 μL Matrigel基质胶的96孔板上。细胞培养箱中培养4 h后在显微镜下统计并拍照。
1.7 统计学分析
应用SPSS 22.0统计软件进行统计分析,计量资料采用表示。组间比较采用t检验、秩和检验或单因素方差分析,组间两两比较进行Bonferroni检验。P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SNORA31在中国脑胶质瘤基因组图谱(Chinese glioma genome atlas,CGGA)数据库(http://www.cgga.org.cn/)中的生存分析和GSCs中的表达
图1 CGGA数据库中的生存分析及GSCs中SNORA31的表达Fig.1 Survival analysis of data from the CGGA database and SNORA31 expression in GSCs
CGGA数据库中生存分析结果显示,SNORA31的高表达与患者的不良预后呈正相关。为了进一步明确GSCs中SNORA31的表达,qRT-PCR检测结果显示,与亲本细胞组(1.00±0)比较,GSCs(5.11±1.58)中SNORA31表达显著增多(P< 0.05)。见图1。
2.2 敲减SNORA31对GSCs中EphA2表达、p-ERK1/2/ERK1/2、p-PI3K/ PI3K比值的影响
qRT-PCR方法检测敲减SNORA31的转染效率,Western blotting检测敲减SNORA31对GSCs中EphA2、p-ERK1/2/ ERK1/2、p-PI3K/ PI3K表达的作用。结果显示,与sh-NC组比较,sh-SNORA31组EphA2表达,p-ERK1/2/ERK1/2、p-PI3K/PI3K比值均显著降低(均P< 0.01)。见图2。
2.3 敲减SNORA31对GSCs血管生成拟态的作用
图2 敲减SNORA31对GSCs中血管生成拟态相关分子表达的影响Fig.2 Effect of SNORA31 knockdown on the levels of molecules related to the vasculogenic mimicry of GSCs
CCK8实验检测结果显示,敲减SNORA31可显著抑制GSCs的增殖。Transwell实验结果显示,敲减SNORA31显著抑制GSCs的迁移和侵袭。基质胶三维管形成实验结果显示,敲减SNORA31显著抑制GSCs的血管生成拟态能力。见图3。
图3 敲减SNORA31对GSCs增殖、迁移、侵袭和血管生成拟态的影响Fig.3 Effects of SNORA31 knockdown on proliferation,migration,invasion,and vasculogenic mimicry of GSCs
3 讨论
GSCs是胶质瘤细胞中的重要亚群,它具有自我更新、低分化、多向分化能力等特点。目前,肿瘤细胞提取干细胞主要有2个方案:(1)肿瘤细胞系的培养与干细胞鉴定;(2)通过临床上获取新鲜的人原代肿瘤组织分离培养后进行干细胞鉴定。由于第2种方案来源于人原代肿瘤细胞,实验结论更具可信性,因此本研究采用这类细胞进行研究。
snoRNAs是广泛存在于真核细胞核仁的小分子非编码RNA,由内含子编码,长度60~300 nt。snoRNAs根据含有保守结构元件的不同种类分为C/D snoRNAs、H/ACA snoRNAs和MRP RNA。snoRNAs在核糖体RNA修饰方面发挥重要的功能。研究[6]表明,snoRNAs表达失调能够调节多种肿瘤的发生发展。SNORD76在胶质母细胞瘤中低表达,过表达SNORD76抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖能力[9]。SNORA42调控大肠癌细胞的增殖能力与分化能力,并且已经成为预测大肠癌患者复发和预后的生物学标志物[10]。本研究在CGGA数据库中的生存分析结果显示,SNORA31的表达水平与患者的生存期显著相关,进一步对GSCs中SNORA31表达的检测结果表明,SNORA31在GSCs中高表达。因此,本研究对SNORA31在GSCs中的作用进行研究。
EphA2是Eph受体酪氨酸激酶亚家族的成员之一,可以通过直接的细胞间相互作用与膜结合的ephrin配体相互作用,进而导致信号通路的双向激活。EphA2在胚胎组织和体内稳态以及维持成人体内细胞增殖、血管生成和干细胞分化等生物学进程中发挥关键作用[11]。肿瘤相关研究[12-16]发现EphA2的异常表达与胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等密切相关。敲减EphA2能够在体外抑制黑色素瘤的血管生成拟态[17]。EphA2通过FAK驱动ERK1/2的磷酸化,激活血管生成拟态的形成[18]。在胃癌中,肿瘤相关成纤维细胞通过EphA2-PI3K信号传导促进胃癌细胞的血管生成拟态形成[19]。本研究检测结果发现,敲减SNORA31的GSCs中EphA2表达与p-ERK1/2/ ERK1/2、p-PI3K/ PI3K比值均显著降低;CCK8实验、Transwell实验及基质胶三维管形成实验结果显示敲减SNORA31显著抑制GSCs的增殖、迁移、侵袭、血管生成拟态。
综上所述,敲减SNORA31抑制了EphA2的表达及ERK1/2、PI3K的磷酸化,进而抑制了GSCs的增殖、迁移、侵袭和血管生成拟态的形成。提示SNORA31可能成为胶质母细胞瘤治疗的潜在靶点。