C7-位白杨素衍生物的生物活性研究

李红侠，吴长昊，王 晴，王 静

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

白杨素，又叫白杨黄素，是一种黄酮类化合物，化学名为5,7-二羟黄酮. 白杨素具有广泛的生物活性，如抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗焦虑[3]、抗菌[4]、抗肿瘤[5]等. 其中抗肿瘤活性引起了科研人员的关注[6-9]. 到目前为止癌症是最难以攻克的疑难杂症之一，在世界范围内每年有800万人死于癌症,且每年死于癌症的人数仍在增加. 对于抗癌药物的研究很自然就成为了药物研究的热点和重点. 白杨素能诱导人肝癌细胞系、胃癌以及乳腺癌等癌细胞的增殖效果[10]. 研究表明，它主要通过拮抗雌激素受体，抑制MCF-7细胞的DNA合成. 天然的白杨素脂溶性和水溶性都较差，表现为胃肠道对其的吸收降低，而且5、7位的羟基容易在体内被糖基化，从而导致代谢活性降低，限制了临床的应用[11]. 为了弥补这些不足，目前科研工作者用白杨素作为主要原材料，通过改变白杨素衍生物的结构来获得生物利用度可观的、选择性好的、没有毒副作用的白杨素化合物. 目前对白杨素母体的改造，主要是在白杨素的 4、5 和 7 位进行结构修饰，一般通过药效团拼合、亲水性胺基侧链、酯化、金属配合物和生物电子等排等，形成小分子的定向化学修饰，得到白杨素的衍生物，并对其生物活性进行研究[12-15]. 现代药理学研究表明,影响药物吸收的一个重要因素是膜通透性,它与脂溶性有关. 药物脂溶性的高低与细胞吸收的效率成正比. 哌嗪具有抗肿瘤谱广、毒性低(LD50mg/kg)、易溶于水等优点[16-17]. 为了增加药物的脂溶性,将哌嗪引入到白杨素中[18],对白杨素的C7位进行结构修饰，获得白杨素衍生物，以期获得细胞吸收较好的抗癌先导物.

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：HeLa细胞，MCF-7细胞，A549细胞，293T(上海通派生物科技有限公司).

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：倒置荧光显微镜(Olympus IX71,日本Olympus)； Heracel CO2培养箱(美国Kendro)，流式细胞仪(BD)； 扫描酶标仪(Sunrise，奥地利TECAN).

主要试剂：C7-白杨素衍生物(本院药物实验室合成)； 新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 溴化四甲基偶氮唑蓝(阿拉丁)； DMEM培养基、双抗(南京化学试剂有限公司)； Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(北京索莱宝). 其他试剂均为分析纯，均购于上海国药集团.

1.3 方法

1.3.1 细胞毒性实验

采用的细胞株是人源胚胎肾上皮细胞，即293T. 取刚长至完整单层的一瓶细胞，胰蛋白酶消化，吹打均匀. 再将生长至对数期的293T细胞接种到细胞培养板中，将细胞稀释至大约105个/毫升. 200微升/孔，置于培养箱(5%的二氧化碳，温度37 ℃)中培养. 正常组、阳性对照组和药物组，继续培养12 h后加药，每组重复处理3次.

加药24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 15 μL，摇匀，置于培养箱中继续孵育4 h. 吸出培养液，每孔加入二甲亚砜150 μL，于摇床摇动8～10 min，使细胞内结晶充分溶解. 于酶标仪(波长490 nm)检测各孔的吸光值(OD)，根据吸光值计算CC50值.

1.3.2 抗增殖活性测试

在培养好的单层细胞中加入胰蛋白酶进行消化，用枪小心吹打，收集细胞. 取两滴细胞悬液经台盼蓝(Trypan Blue)染色后置于倒置显微镜下，计下活细胞数目(死的细胞数量应小于或等于5%). 将细胞数目调至1×105个/毫升细胞，接种到细胞培养板(96孔)中，200微升/孔，置于培养箱(5%的二氧化碳，温度37 ℃)中培养12 h之后取出培养板，取出培养板后于每孔中加100μL含不同浓度被测样品的溶液，使得药物最终浓度分别为0、10、50、100、150 μM/L. 对照组不加药品，重复3次. 加完药后于摇床上轻轻混匀，然后置于细胞培养箱中继续培养24 h. 取出培养板，每孔加入二甲亚砜150 μL，于摇床均匀晃动10 min左右，用酶标仪测定每孔的吸光度值. 根据各孔的吸光度值，算出药物对细胞增殖的IC50值.

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 双染色流式细胞术检测细胞凋亡

将HeLa细胞培养至生长对数期，调细胞浓度，以105个/毫升细胞浓度，将HeLa细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔加细胞悬液2 mL，12 h后加药，最终浓度分别为0、10、15、20 μM/L. 对照组加细胞培养基2 mL. 培养24 h后将细胞处理，胰酶消化，3500 r/min离心5 min后弃去上清，用冷的PBS洗涤两次后，加Binding Buffer 300 μL 轻轻混匀，再加入5 μL Annexin V-FITC/PI和5 μL PI，轻轻混匀，再加入200 μL Binding Buffer混匀，室温避光反应10～15 min，于流式细胞仪检测细胞凋亡，每组样品收集细胞1万个. 使用 FlowJo 7.6.1(FACSCA2BUR, Becton Dickinson，USA)软件进行数据分析及出图.

2 结果与分析

2.1 药物对293T的毒性分析

通过MTT法测试该化合物对人肾上皮细胞293T的毒性，结果药物对人肾上腺上皮细胞株-293T细胞的CC50值为(113.56±0.43)μM/L，阳性对照药厄洛替尼的CC50值为(89.52±0.43)μM/L，说明该药物的毒性很低，处于毒性安全区.

2.2 药物对肿瘤细胞的抗增殖活性

由表1可知，白杨素C7位结构经修饰后，对3种肿瘤细胞的抗增殖性明显高于白杨素本身，尤其对HeLa细胞的效果较好，IC50值为(20.62±0.35)μmol/L. 但与对照药厄洛替尼相比，没有对照药的效果好.

表1 白杨素衍生物对HeLa、MCF-7、A549细胞的抗增殖活性(IC50， μmol/L)

2.3 药物对细胞凋亡的结果分析

为了检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响，选用抑制增殖效果最好的宫颈癌细胞(HeLa)，设置了不同药物浓度梯度的流式细胞凋亡实验，结果如图1所示. 当药物浓度分别为10、15、20 μM/L时，细胞凋亡率分别为11.02%、14.39%、22.32%，没经药物处理的对照的细胞凋亡率为1.39%. 可以看出，随药物浓度的增加，细胞凋亡率也增加，与药物浓度呈剂量依赖性.

3 讨论

本研究的药物是在白杨素的7-位羟基上进行修饰，将得到的药物进行体外肿瘤细胞的一系列实验. 根据对HeLa、MCF-7、A549细胞的体外测试结果，药物的生物活性(抗肿瘤细胞)明显增强，尤其对HeLa细胞，IC50值为20.62 μmol/L； 在细胞凋亡实验中，引起细胞凋亡率与药物剂量呈依赖关系. 这些结果为今后进一步研究白杨素衍生物的其他生物活性提供一定的参考依据.

图1 药物对HeLa细胞24 h后的细胞凋亡