化痰散结方对人胃癌MKN45 细胞的体内外抑制作用∗

王 华，郭 维，2△，孙 琪，2

1 宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川750004;2 宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室

胃癌是常见的消化道肿瘤，因其侵袭和转移致预后极差，死亡率高［1］。中医认为，痰浊与胃癌的发病关系密切。痰的特点是胶着难去，随气升降，无处不到［2-3］，其特点与肿瘤的特性十分相似。《丹溪心法》曰：“凡人身，上中下有块者，多是痰。”充分说明痰与肿瘤的关系［4］。基于此，化痰法治疗肿瘤成为临床常用的大法，本课题组前期自拟化痰散结方治疗胃癌，取得较好疗效，现进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物MKN45 人胃癌细胞株（中国科学院上海生科院细胞资源中心）；健康SD 雄性大鼠10 只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK90（宁）2015-0001；BALB/C裸鼠，均选用雄性裸鼠24 只，体质量（21±2）g，在宁夏医科大学动物中心SPF 条件下饲养，实验动物许可证号：SCXK（京）20160006。

1.2 药物化痰散结方药物组成：半夏15 g，天南星15 g，浙贝10 g，生牡蛎30 g，全蝎6 g，地龙6 g，守宫6 g，乌贼骨15 g，炙甘草6 g，木蝴蝶15 g，凤凰衣15 g，刺猬皮10 g，山甲粉3 g，蜈蚣6 g，藤梨根15 g，由宁夏医科大学附属回医中医医院制成浓度为1.56 g/mL 的水煎剂。注射用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）由上海旭东海普药业有限公司生产。

1.3 试剂与仪器胎牛血清（gibco，批号：1739463）；CCK-8 试剂(日本同仁化学，批号：LK815)；胰蛋白酶(北京索莱宝生物有限公司，批号：T1302)；PBS缓冲液（批号：AD20616267）、RPMI-1640 培养基（HyClon 公司,批号：AC10375291)；OB 医用吻合胶（广州白云山医药集团股份有限公司，批号：160108）。恒温CO2培养箱HF-90（Thermo Scientific）；倒置显微镜CKX31（OLYMPUS Corporation）；连续波长及核酸蛋白微量检测酶标议（Tecan 瑞士）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组将MNK45 胃癌细胞分别接种于T25的培养皿中，5%CO2、37℃培养箱中培养，待细胞生长成对数生长期进行实验。按照处理条件不同分为空白血清组及5%、10%、15%、20%含药血清组。

1.4.2 含药血清的制备SD 大鼠10 只，体质量（180±20）g，适应性饲养7 天后随机分为空白组和给药组，每组5 只。给药组给予化痰散结方药液（浓度1.56 g/mL），空白组给予等剂量生理盐水，每日1次，每次灌胃2 mL，连续7天。末次灌药（灌药前禁食不禁水12 h）2 h后，10%水合氯醛麻醉，心尖采血，静置2 h后，离心半径16 cm，3500 r/min离心10 min后收集血清，同组血清混合置于离心管中，用0.22µm微孔滤膜过滤除菌，-80℃分装保存备用。

1.4.3 CCK-8 法检测胃癌细胞株增殖用胰酶消化处于对数生长期细胞，用培养基分别稀释成细胞悬液，接种于96 孔板中，每孔100µL（5×103个/孔），培养24 h，待细胞贴壁。弃去原有培养液，加无血清培养液，饥饿12 h 后，分别加入含药血清或空白血清培养液100 µL，继续分别培养24、48、72 h。每孔加入10µL CCK-8 溶液，再培养1 h。用酶联免疫检测仪在波长450 nm 处读取光密度（OD 值），计算抑制率。每组每时段均设3 个重复孔。抑制率（%）=［1-（给药组OD 值/空白对照组OD值）］×100%。

1.5 裸鼠移植瘤的建立与分组培养胃癌细胞至对数期，配制成细胞浓度为1×107cells/100µL PBS 的细胞悬液，接种于裸鼠右侧腋下皮肤，每只0.2 mL。待瘤体生长至直径约10 mm 时取出瘤块，将瘤块送至裸鼠右腋下生长至10 mm时，再重复上述过程进行传代，此过程反复3 次，并将瘤块切成小组织块备用。术前禁食12 h，麻醉，消毒皮肤后，在鼠胃大弯侧血管丰富区划开，观察到出血后将组织块接种于此，滴少量OB 胶，待粘合牢固后，逐层关腹。造模24 h 后开始给药，将裸鼠分为模型组灌胃生理盐水0.02 mL/g，中药组灌胃化痰散结方汤剂0.02 ml/g，每天1 次，5-fu 组腹腔注射25 mg/kg，隔天1 次，连续4 周。停药后将裸鼠处死，开腹取肿瘤，并称重。抑瘤率（%）=［1-（给药组平均瘤重/模型组平均瘤重）］×100%。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况模型组裸鼠饮食减少，活动度较差，后期出现消瘦。中药组裸鼠饮食量、活动度和精神状态较稳定。5-fu 组裸鼠相继出现粪质偏稀，食欲减退，活动度欠佳。中药组较其他两组在改善一般状况方面作用较好。

2.2 化痰散结含药血清对MKN45 胃癌细胞株增殖的影响与空白血清组比较，化痰散结含药血清能不同程度抑制MKN45 细胞增殖，呈现出剂量-效应关系。见表1、图1。

表1 化痰散结含药血清对MKN45胃癌细胞株增殖的影响（±s）

表1 化痰散结含药血清对MKN45胃癌细胞株增殖的影响（±s）

注：#表示与空白血清组比较，P＜0.05；□表示与5%含药血清组比较，P＜0.05；*表示与10%含药血清组比较，P＜0.05；△表示与15%含药血清组比较，P＜0.05

图1 化痰散结含药血清对MKN45胃癌细胞抑制率的影响

2.3 化痰散结方对移植瘤生长的抑制作用瘤质量中药组和5-fu 组与模型组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。5-fu 组和中药组的抑瘤率分别为57.81%和44.53%，提示5-fu 组抑瘤效果较中药组好。小鼠体质量模型组治疗前后比较差异无统计学意义（P＞0.05），5-fu 组、中药组与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示在改善生存质量方面中药组优于西药组。见表2―3。

表2 各组裸鼠瘤质量和抑瘤率比较（±s）

表2 各组裸鼠瘤质量和抑瘤率比较（±s）

注：#表示与模型组比较，P＜0.01

表3 各组裸鼠治疗前后体质量比较（±s） g

表3 各组裸鼠治疗前后体质量比较（±s） g

注：与模型组治疗后比较，△表示P＜0.05，#表示P＜0.01

3 讨论与展望

肿瘤乃有形实邪，治疗多用“结者散之”“坚者削之”法。化痰散结法联合化疗能改善中晚期胃癌患者生存质量，增效减毒［5］；温阳化痰散结方能抑制乳腺癌荷瘤鼠肿瘤生长，改善生存期［6］。化痰散结类中药能抑制肿瘤生长转移［7］，逆转耐药［8］。本研究结果表明，化痰散结方含药血清对MKN45 细胞的抑制增殖呈现时间和浓度相关性。通过一般情况（如精神状态、饮食量、活动度等）可知，5-fu 组化疗副作用明显。总之，化痰散结方可抑制胃癌MKN45 细胞生长增殖，改善裸鼠生存质量。

胃癌属中医学“积聚”“癥瘕”等范畴。《疡科心得集》云：“癌瘤者，非阴阳正气所结肿，乃五脏瘀血浊气痰滞而成。”郭维导师在临床诊治中体会到，肿瘤非单一邪气所为，也非单纯寒证和热证，而是寒热胶结［9］，再与痰瘀等邪气相合，日久成积化毒致癌。方中半夏、天南星燥湿化痰，浙贝、生牡蛎软坚散结为君药。全蝎、地龙、守宫、蜈蚣和山甲粉通络散结为臣药。现代药理研究［6-7］证明一些动物药中所含成分具有抑制或杀灭癌细胞、增强机体对肿瘤的免疫力、抑制转移、止癌性疼痛等作用。木蝴蝶和胃，凤凰衣养阴，刺猬皮散瘀止痛，乌贼骨制酸消炎止痛，藤梨根清热解毒活血为佐药。炙甘草调和诸药为使药。该方辛开苦降，寒热并用，具有化痰散结，和胃止痛，养阴解毒之功。

此外，胃癌MKN45 细胞株是否为痰湿凝结证型，化痰散结方对其他胃癌细胞株的作用及胃癌细胞株与中医胃癌证型相关性（即某一种细胞株能否代表某种疾病的证型），后期将通过其他胃癌细胞株进行探讨。