环形泰勒虫转化细胞中关键分子的研究现状

2021-03-30史康妍赵保才周子成赵洪喜

动物医学进展 2021年11期

蒋晨，李霞，史康妍，赵保才，周子成，赵洪喜

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

环形泰勒虫病(Annular theileriasis)，又称为地中岸热或者热带泰勒虫病，是以蜱为媒介的顶复门、梨形虫纲、泰勒虫科、泰勒虫属的环形泰勒虫(T.annulata)寄生于动物的单核巨噬系统细胞及红细胞而引起的血液原虫病[1]。本病的主要临床症状和病理变化是高热稽留、贫血、体表(全身性)淋巴结肿大、全身性出血、消瘦、发热、血小板减少、白细胞减少、肺水肿和胸腔积液，肾脏外膜易剥离。第三胃内容物干燥，第四胃黏膜肿胀，其边缘隆起，中间凹，呈现灰色，溃疡面积约占80%[2-3]。该病通常是由寄生虫的子孢子在进食过程中从蜱的唾液腺中释放出来，侵入并在牛淋巴细胞中建立感染[4]。在感染期间，白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达上调，一氧化氮(NO)的产生增加，从而导致牛单核细胞的分子和功能表型改变[5]。本病在世界范围内分布，全球每年大约有2.5亿头牛受到本病的威胁，造成的损失大约8亿美元，被世界动物性组织(OIE)列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。目前对本病的治疗没有特效药物，主要以预防为主，诊断方法包括显微镜观察法、血清学和分子生物学诊断法，但是没有一种方法可以准确地诊断和防治[6]。

目前正在研究的免疫抗原主要有子孢子表面抗原、裂殖子表面抗原、裂殖体表面抗原和热休克蛋白等，这些表面抗原具有良好的免疫原性和生理功能，具有药物和疫苗的开发潜力，可以作为药物和疫苗的候选位点，为本病的防治提供新的方法和途径。

1 子孢子表面抗原蛋白

子孢子表面抗原蛋白是环形泰勒虫在子孢子阶段分泌的一种膜蛋白，高度保守又具有良好的免疫原性，可以作为药物和疫苗的候选抗原。对于子孢子表面蛋白SPAG-1和p67都具有很好的抗原性，SPAG-1的抗原性可能是发生在C端的16个残基，这16个残基可能需要一些表位来激活才具有抗原性，而p67的抗原部分可能包括SPAG-1 C端部分，所以单独使用也可以产生保护力。Darghouth M等[7]用重组全长SPAG-1 His标签蛋白和减毒的裂殖体去诱导同源和异源的子孢子攻击，结果表明，两者都可以提供部分保护，而且两者组合使用可提供最佳保护作用，这可能是C端16个残基不能被子孢子所识别，无法感染子孢子，所以SPAG-1和减毒细胞系都是潜在的亚单位疫苗。

Kaba S等[8]用p67的结构域与绿色荧光蛋白(GFP)的羧基末端融合表达，融合表达的p67蛋白其稳定性和表达能力都获得了增强，单克隆抗体的表位也变得比较保守，使其更接近天然的p67蛋白构象，对p67蛋白进行纯化免疫可以产生部分保护力，推测这种保护力可能是p67部分区域发挥的作用，这和Tebaldi G等[9]研究结果相同，其在分别表达全长p67抗原和截短的p67抗原，发现这两种形式的重组p67与抗p67分子发生单克隆反应，该抗体可以与天然的子孢子反应，在山羊和牛中具有免疫原性。Lacasta A等[10]发现p67(p67C)的C端部分与ISA206VG佐剂3种剂量在群体水平上的保护作用(46%)与单独使用p67蛋白的保护作用相似，而且p67C体积小，蛋白质稳定，表达产量高，抗体效价高，可以刺激CD4+T细胞增殖，推测p67C是潜在的亚单位疫苗。Nyagwange J等[11]对筛选出来的4种潜在的疫苗候选者进行体外中和子孢子感染，发现p13的中和能力比gp34蛋白和p104蛋白都强，可以产生最强子孢子中和活性抗体，在宿主-寄生虫中发挥作用，对这些抗原抗体进行测试，确认了其作为候选抗原疫苗的作用。子孢子表面抗原蛋白SPAG-1的C端和p67的结构域都有较好的免疫原性，而且这两种蛋白又具有同源性，氨基酸相似序列高达54%，与宿主细胞的识别和侵袭有关，推测其可能有相同的部分起到相同的保护作用，如Tebaldi G表达的p67蛋白可以刺激淋巴细胞增殖，间接提高机体的抵抗力，从而达到防护作用，为以后药物和疫苗的研究提供基础。

2 裂殖体表面蛋白

裂殖体表面蛋白是环形泰勒虫在生长发育阶段分泌的一种膜内蛋白，具有良好的免疫原性，基因序列非常保守，适合用来诊断环形泰勒虫病。这些抗原性的蛋白在被合成后应该在胞内被其它物质相互连接在一起激活具有蛋白活性后才能有更多抗原位点以至于有很好的抗原性。Silatsa B等[12]首次在没有蜱媒介的喀麦隆使用p104 PCR从牛血液样本中筛选出阳性，对p104进行基因分析，存在的Tp1 CD8表位与Muguga Cocktail ITM疫苗的Tp1 CD8表位相同，这可能是人为介导ITM活疫苗的动物运动导致的。Salih D等[13]证实了这一推测，在苏丹的牛群中确定了CD8+T细胞识别的抗原Tp1和Tp2之间的序列多样性，分别产生4和14个抗原变体，而这些抗原变体的多数等位基因与活疫苗混合物中Muguga成分相似，由此可见这确实是人为导致的结果。Svitek N等[14]研究CD8+T细胞识别的Tp1抗原的保护作用，发现Tp1可以刺激CD8+T细胞增殖和CTL产生特异性应答，抵御部分保护作用，这种保护作用可能是p104发挥的作用。Huber S等[15]用共免疫沉淀技术研究微管蛋白CLASP1与裂殖体膜蛋白p104的关系，发现两者是通过EB1间接链接的，CLASP1与EB1是通过崁入MT结合域中的两个SxIP基序介导的，p104是与崁入富含脯氨酸的C末端结构域中的SxIP模体与宿主细胞的EB1相互作用的，二者间接连接，共同定位到裂殖体边表面，与蛋白质的编码和维持转化表型有关。Huber S等[16]以CLASP1为诱饵，使用BioID、荧光显微镜和免疫共沉淀技术，鉴定了微管和SH3结构域相互作用的蛋白TaMISHIP，该蛋白定位于裂殖体表面，包含2个EB1结合SxIP基序，3个推定的SH3结合Px(P/A)xPR基序，2个核定位和核输出信号组成的区域，Px(P/A)xPA基序负责将CD2AP募集到裂殖体表面，使TaMISHIP蛋白和CD2AP发生特异性作用。CD2AP与CIN85序列和结构相似，其结合配偶体参与胞质分裂、信号转导、小泡运输等。CIN85可以将受体信号连接NF-κB途径，使IκB和JNK1磷酸化水平降低，IKK复合物的体外激酶活性受损，从而导致NF-κB抑制剂的降解和NF-κB途径的激活。CD2AP可以与抑癌蛋白p53结合，将信号分子募集到裂殖体表面来促进泰勒虫诱导的转化。

Alhosary A等[17]以Tams-1 PCR为对照来评估TASP蛋白商业ELISA试剂盒的可靠性，与PCR数据相比，试剂盒灵敏度为91.25%，特异性为78.4%，两者的结果有良好的相关性，是检测慢性和携带动物寄生虫抗体的较好工具。Ulrike Ssitzer等研究发现，裂殖体表面蛋白TASP被3个膜结构域分成大段、小段、N端和C端，大段中包含蛋白质的多态性区域可以刺激宿主细胞产生TASP抗体，推测TASP有意义的抗原部分可能是在被切开的大段部分，就如Sadr N等[18]研究发现这部分多态性在种间和种内都可以检测到，Tasp基因序列有90%～94%的同一性和68%～94%的氨基酸同源性，而且不同特征的TASP蛋白有些区域相同，说明TASP多态性区域非常保守，在宿主细胞中可以产生很强的免疫应答，这部分免疫应答可能是由多态性区域或者某些相同区域翻译的蛋白质所刺激，我们可以通过重组这些区域蛋白刺激宿主产生抗体，有助于重组蛋白疫苗和诊断产品的开发。Bilgic H等[19]通过生物信息学鉴定了编码预测抗原基因，挖掘出免疫显性抗原基因，并且用TASP蛋白建立一种ELISA方法，结果表明TASP蛋白的表现最好。Aquil M等[20]以重组的TASP为抗原，用DOT-ELISA方法检测样品血清中的特异性抗体，结果表明TASP蛋白的敏感性和特异性为95.8%和80%，说明抗体滴度和免疫效价都非常高，免疫原性非常好，可成为检测环形泰勒虫病的一种方法。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)抗体可以在寄生虫入侵方面有保护作用，糖基磷脂酰肌醇(GPI)诱导的促炎性细胞因子TNF-α和IL-6可以促成疾病的发病机理，通过中和GPI的刺激活性来提供针对机体的保护。Mbengue B等[21]在携带高寄生虫血症的个体中测出高水平的GPI抗体，并且糖基磷脂酰肌醇的炎性细胞因子和体液反应与寄生虫病免疫力和发病机理相关。Abbasnia A等[22]通过高效液相色谱从纯化的裂殖体中分离出GPI，并通过ELISA测定抗GPI抗体，结果表明，自然感染和接种动物血清中存在高含量抗GPI抗体。GPI蛋白在寄生虫-宿主细胞相互作用中起重要作用，有很好的免疫原性，可以诱导促炎性因子TNF-α的释放和抗体反应，与宿主免疫应答的产生有关，可以用作开发疫苗和GPI疗法。不过在用裂殖体制作减毒疫苗时，随着长期传代培养会导致基因型的丧失，降低寄生虫的多样性，从而达不到保护作用，所以需要增强多样性来对当前疫苗进行修饰，加强保护作用[23-24]。

3 裂殖子表面蛋白

裂殖子表面蛋白是环形泰勒虫在进入红细胞时分泌的一种膜蛋白，具有很好的免疫原性，基因序列非常保守，Lempereur L等[25]对环形泰勒虫具有传输阻断反应的编码抗原寄生虫基因进行筛选，发现Tams1等位基因显示有最高的dN / dS比，具有6个显著的阳性选择位点，表面抗原的不同表位具有高度依赖性并且蛋白质稳定，适合做疫苗的候选抗原。Abakeri A等[26]使用3种方法对苏丹尼亚拉地区162头奶牛进行环形泰勒虫的检测，发现Tams1聚合酶链反应阳性率最高，准确率高，与Tams1蛋白多阳性位点相对应。Roy S等[27]通过微卫星标记基因分型，GBS分析和Tams1基因多态性分析，确定了泰勒虫多种基因型的存在，揭示了寄生虫和疫苗之间的遗传和等位基因的多样性，有助于确定新的疫苗目标和控制该疾病的政策。Katzer F等[28]研究表明，对DNA水平上44个多样性等位基因Tams1进行克隆、测序和鉴别，对比出保守性、变异性和高变异区域，结果表明，序列的多样性反映在抗原性中，在多肽性区域内可变的糖基化位点和氨基酸表位的变化是虫体适应外界环境所作出的改变，与虫体入侵宿主细胞和免疫逃避有关，因此该基因疫苗应该注重多肽设计。

4 热休克蛋白

从细菌到哺乳动物，热休克蛋白广泛存在于其体内，发挥重要生理功能，主要负责调节细胞的应激能力。热休克蛋白是伴侣蛋白，按照蛋白的分子大小分为5类，包括Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子热休克蛋白。其中，最为重要的是Hsp70家族蛋白，Hsp70家族蛋白各分子量相近，序列具有高度保守性，在应激细胞中被高度诱导表达，具有保护机体和细胞的功能[32]。

环形泰勒虫在入侵宿主时，虫体因外界环境的改变发生应激反应，热休克因子1(HSF1)和缺氧诱导因子1(HIF-1)协同诱导Hsp的高度表达，有助于虫体在宿主内更好的适应环境，使虫体免疫逃逸宿主的检测，Hsp和膜表面Hsp可以被抗原呈递细胞表达的CD91+所识别，发挥免疫刺激作用，产生抗虫体蛋白抗体，抵御环形泰勒虫入侵[30]。Hsp70在每个生活阶段都有表达，在裂殖体阶段表达程度更高，蛋白合成后经过加工具有活性。

另外，Hsp90蛋白在虫体感染过程中发挥重大的作用。Sun H等[31]研究表明，Hsp90蛋白可以调节人红细胞中的寄生虫生长，维持寄生虫的活力和增殖，在宿主细胞入侵以及生长和毒力中起重要的作用。Hsp90蛋白定位于表面，在寄生虫中充当热传感器，可以增强寄生虫的毒力，它的底物是激酶IKK，它可以降解转录因子NF-κB的抑制剂，使转录因子NF-κB易位至细胞核，从而导致炎症和细胞凋亡基因的激活[32]。Hsp90蛋白有4种亚型，每种亚型长度相差不大。Kinnarid J等[33]建立了系统发育树，对感染环形泰勒虫的转化白细胞分析Hsp90亚型特征，确定了每种亚型的定位和格尔德霉素和衍生物17-AAG的作用，对17-AAG的抑制非常敏感。Guswanto A等[34]研究表明，格尔德霉素可以通过结合Hsp90降低寄生虫的成活率，抑制泰勒虫的正常繁殖，可以作为泰勒虫的潜在药物靶标。热休克蛋白具有很好的抗原性，可以刺激宿主产生免疫应答，所以可作为治疗和诊断本病的候选蛋白。