副猪嗜血杆菌毒力基因及其致病机制研究进展

叶俊贤，刘郁夫，冯夏宁，陈瑞爱*

(1.华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司，肇庆 526238；2.华南农业大学兽医学院，广州 510642；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，肇庆 526238)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一种呈短杆状的革兰氏阴性菌，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员，是引起猪革拉泽氏病(Glasser's disease)的病原。HPS寄生于健康猪的上呼吸道，正常情况下不发病，但在应激环境或与其他病毒性病原混合感染情况下，HPS可突破黏膜屏障，通过血液循环定植到其他内脏器官，引起以呼吸道症状、胸腔和腹腔大量纤维素性物质渗出、心包积液和关节炎为特征的呼吸道疾病[1]。HPS发病率高，病情严重时病死率可达50%，给养猪业带来巨大经济损失，是影响养猪业发展的重要细菌性病原之一。特别是在养殖业“减抗、禁抗”政策的大环境下，HPS引起的发病有上升趋势[2]。

HPS的毒力因子众多，致病机制复杂，针对毒力基因的作用和致病机制研究是热点之一。已成功鉴定多个HPS毒力相关基因，并阐明其作用机制，如OMP P2蛋白、OMP P5蛋白、IgA蛋白酶、三聚体自转运蛋白等[3-4]。近几年，又陆续在HPS毒力相关的膜蛋白分子、毒力相关的转录调控因子以及致病机制研究方面取得新进展。本文拟对HPS毒力基因、病原与宿主之间相互作用等进行综述，为HPS基础研究、新型防控技术和新药研发提供参考。

1 HPS毒力相关的膜蛋白分子

1.1 脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)

脂寡糖是HPS细菌外膜上的糖脂，与大肠埃希氏菌LPS的结构和生物学功能相似，但缺失了O抗原亚基，因此称为脂寡糖。HPS脂寡糖除了可诱导巨噬细胞产生炎性细胞因子，还在细菌吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用[5]，LOS是HPS的重要毒力因子之一。

已经证实，opsX、rfaF、waaQ和rfaE等4个庚酰转移酶基因参与LOS的合成过程[6]。2016年Zhou Q等研究表明，HPS糖基转移酶基因lgtB和lex-1的失活，均可引起HPS合成LOS的能力缺陷，并导致HPS的血清耐受能力和吸附猪上皮细胞的能力显著低于亲本株[7]。HPS ΔlgtF基因突变株导致形成截短型LOS，截短型LOS刺激巨噬细胞产生炎性细胞因子的mRNA水平显著低于野生型LOS，进一步研究发现这种差异是两种LOS对细胞NF-κB和MAPK信号通路的激活水平不同造成的[8]，也从侧面验证了HPS LOS可被宿主免疫细胞识别，在介导细胞炎性反应中发挥重要作用。Feng S等还从HPS基因组鉴定出一种磷酸葡萄糖变位酶(HAPS-0849)，该蛋白具有磷酸葡萄糖变位酶活性，该基因失活可能阻断细菌合成1-磷酸葡萄糖，进而影响GalU的功能，导致LOS合成受阻[9]。

除了LOS合成相关的上游基因，翻译后修饰过程也对LOS发挥完整的生物学功能至关重要。其中HPS α-2,3-唾液酸转移酶基因(lsgB)介导HPS LOS的唾液酸化过程，该基因突变可导致HPS吸附细胞的能力下降，对小鼠的致病力减弱。

1.2 荚膜

荚膜多糖是HPS一种重要的毒力因子，在吸附宿主细胞、逃逸宿主免疫反应方面起着关键作用。将参与合成荚膜多糖的基因capD缺失，可使HPS致病菌株SH0165对补体介导的杀伤作用更加敏感，且导致细菌毒力下降[10]。Eberle K C等将参与合成荚膜多糖的基因簇缺失，构建HPS荚膜突变株，通过体内外试验证实，荚膜突变导致HPS抵抗猪肺泡巨噬细胞吞噬能力的显著致弱，在猪鼻腔的定殖能力较亲本株弱[11]。HS069Δcap仅能激起微弱的体液免疫反应，且不能保护强毒攻毒。

荚膜还是HPS重要的免疫原性组分，有人比较猪肺泡巨噬细胞对不同HPS菌株的识别能力，选择血清5型HPS菌株制备荚膜粗提取物(crude capsular extract，cCE)。cCE除了具有与特异性抗体结合的能力，还可诱导机体产生较高的特异性抗体和促炎性细胞因子水平，具有成为新型亚单位疫苗的潜力[12]。

1.3 其他膜蛋白

OMP P2是HPS外膜表面成分最丰富的膜蛋白，在维持细胞膜完整性和通透性发挥重要作用，还可参与病原与宿主之间的相互作用，但OMP P2蛋白哪些表面环状结构是参与宿主识别过程的重要功能域仍然未知。Zhou Y等通过合成肽刺激巨噬细胞试验结合HPS缺失株构建，明确了OMP P2 L7和L8是主要刺激机体产生炎性细胞因子的表面环状结构，并证明该作用是通过激活NF-κB信号通路引起的[4]。

VacJ是一种细菌外膜上的脂蛋白，参与多种病原菌的致病过程。HPSvacJ基因突变使细菌的细胞完整性受到破坏，并伴随着HPS细菌形态的改变以及HPS对SDS、渗透压和氧化应激的敏感性增加，ΔvacJ对Balb/c小鼠的半数致死剂量较亲本株上升15倍[13]。VacJ重组蛋白具有较强的免疫原性，能诱导免疫猪产生较高的抗体水平和提高产γ干扰素细胞的数量，但同样也不能保护强毒攻毒[14]。

三聚体子转运蛋白家族成员(virulence associated trimeric autotransporters，VtaA)在HPS细胞膜表面组成了细菌五型分泌系统，参与病原与宿主之间的互作，所有VtaA蛋白都具有与黏附素、血凝素和侵袭素结合的特殊结构域。Costa H M等利用大肠埃希氏菌体外表达，并鉴定VtaA2的生物学功能，发现VtaA2有助于细菌对塑料、黏蛋白、BSA、纤维连接蛋白和胶原的吸附作用[15]，且中央胶原结构域是其发挥功能的主要结构域。

Jiang R等[16]系统分析了HPS生物被膜的成分以及形成的动态过程，通过转录组测序分析筛选出最可能与细菌定植和吸附相关的基因(artM、artQ、ssrS、pflA和HutX)，这些基因主要参与生物合成的二级代谢、ABC转运系统、淀粉和蔗糖代谢等细菌生物学过程，为深入研究HPS调控生物被膜形成的机制提供基础。

新型亚单位疫苗的研制是HPS疫苗研究的热点，而针对HPS膜蛋白的研究将有助于充分认识这些膜蛋白的生物学功能将为疫苗研究提供参考。尽管大多数HPS膜蛋白具有较强的免疫原性，但攻毒保护试验结果往往不理想，其中佐剂成分可能是影响HPS重组蛋白疫苗的效力关键组分[17]。

2 毒力相关的转录调控分子

二元调控系统CpxRA和CheY/QseC参与调节多种致病菌的环境适应性和细菌毒力。Cao Q等研究显示，cpxR基因突变导致HPS对氧化应激、渗透压应激、酸性环境和大环内酯类药物的敏感性改变，通过RT-PCR鉴定出2个编码药物外排泵基因的表达下调[18]。QseC是二元调控系统CheY/QseC的组氨酸蛋白激酶，在系统中负责将外界刺激信号转导至胞内，He L等构建HPSΔqseC突变株同样表现出对应激环境耐受能力、铁离子摄取能力和生物被膜合成能力下降的表型[19]，但CpxR和QseC作用的机制和靶点仍需进一步研究。

OxyR属于LysR样蛋白家族成员，N段具有DNA结合结构域，是介导细菌抵抗氧化应激作用的转录调控因子，可直接激活铜绿假单胞菌过氧化物降解酶的表达[20]。HPSΔoxyR突变株的生长速度和生物被膜形成能力被显著抑制。原核转录组测序显示，ΔoxyR突变株466个差异表达基因主要参与氧化应激、转录调控、DNA复制与修复等生物学功能[21]，但对OxyR的直接作用机制尚未解析。

密度感应系统LuxS/AI-2是一种细菌间重要的信号交流方式，已证明在多种致病菌中参与影响毒力。HPSΔluxS突变株产生显著低于亲本株的AI-2信号分子水平，显著影响HPS对氧化应激和热应激环境的耐受能力，并导致HPS对小鼠的致病力下降10倍[22]。

cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP)是一种重要的全局性调控子，在感染过程中调节细菌对环境的适应性。Jiang C等研究显示，crp基因参与调节HPS对高渗透压环境的适应能力、对血清抗性、铁离子摄取能力和生物被膜合成能力，但crp基因与HPS细菌毒力之间的关系仍然未知[23]。

随着基因组学数据不断完善，通过同源基因的比对可不断挖掘HPS毒力相关基因，针对HPS转录调控因子的研究也逐渐增多。Zhou Y Y等通过比较HPS强弱毒株之间的转录组差异表达基因，筛选出10个影响细菌磷酸化系统和ABC转运系统的基因可能参与HPS的致病过程[24]。

3 HPS与宿主的相互作用

3.1 HPS与天然免疫信号通路

HPS感染引起全身性炎症反应，以胸腹腔渗出大量纤维素性物质为主要特征。HPS感染可上调趋化因子RANTES的表达，并且这种上调作用依赖于NF-κB信号通路和JNK信号通路的激活[25]。通过流式细胞技术发现感染HPS猪表达TLR2、Siglecs和CD163细胞表面受体的外周血单核细胞数量显著增加，表明机体在募集白细胞参与抗细菌感染过程中发挥积极作用[26]。研究表明，HPS多胺转运蛋白PotD可通过激活TLR4信号通路，进而激活NF-κB和JNK信号通路以促进巨噬细胞分泌促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，并可通过相应的阻断剂抑制促炎性细胞因子的上调作用[27]。这些研究说明，HPS感染对NF-κB和JNK信号通路有激活作用，并引起下游炎性细胞因子的表达。

HPS除了可激活细胞表面的病原相关模式识别受体，胞内的模式受体(NOD1/2)也参与识别HPS。Ma B等研究发现，HPS感染可上调PK-15细胞NOD2的表达和RIP2的磷酸化水平，且HPS破碎上清、LPS和肽聚糖参与了该过程，继而激活下游NF-κB信号通路的活化以及细胞因子CCL4、CCL5和IL-8的表达[28]。

3.2 HPS与细胞程序性死亡

在HPS感染猪气管细胞的试验中，观察到猪气管细胞以caspase-3依赖的方式引起细胞凋亡；在PK-15细胞和猪肺泡巨噬细胞发现，HPS细胞致死膨胀毒素CtdB引起细胞周期阻滞和p53依赖的细胞凋亡。但HPS其他成分是否可导致细胞凋亡仍然未知。

细胞自噬是指在自噬相关基因的调控下,利用溶酶体降解自身受损的细胞器及大分子物质的过程。Shen Y等用不同毒力的HPS侵染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21，发现HPS诱导细胞自噬水平与侵入细胞的活细菌数密切相关[29]。Yue C等也获得类似的结果，通过激光共聚焦、Western blot和透射电镜证明HPS感染可增强PK-15细胞自噬信号流表达，并利用自噬小体清除体内侵入的细菌，抑制炎症反应避免对机体的损伤[30]，提示细胞自噬是一种抑制细菌感染的机体防御机制。

3.3 HPS与Wnt/β-catenin信号通路

HPS感染宿主引起内脏器官急性炎症反应和广泛性的纤维素性渗出物，但其分子致病机制尚未完全清楚。Wnt/β-catenin信号通路在调节动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其他生理过程中具有至关重要的作用[31]。Hua K等通过体内外研究表明，HPS感染可激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin的表达[32]，进而导致上皮细胞间隙间E-钙黏蛋白降解，引起上皮细胞通透性的改变，造成纤维素性物质从血管淋巴管中渗出。继续对Wnt/β-catenin信号通路的上、下游调控网络进行研究，证实P38-MAPK通路通过阻碍DKK-1(Wnt/β-catenin信号通路抑制剂)的表达，促进Wnt/β-catenin的活化[33]，而β-catenin则通过其靶基因(猪环氧合酶-2，COX-2)间接导致NF-κB活性的下降[34]。

4 展望

HPS毒力因子多且复杂，在筛选毒力相关蛋白的作用靶点时，只能依靠有限的文献资料，并且常常得到阴性结果，因此针对HPS毒力基因的作用机制研究往往比较浅显，大多只进行表型试验，缺乏深入探讨。近些年基因组、转录组、蛋白组、代谢组等组学技术得到快速发展，应用这些新技术将极大推动HPS毒力因子研究的发展。并且随着人们不断拓宽在细胞信号转导领域的认识，也将有助于进一步剖析HPS的分子致病机制，为将来HPS新型防控技术和新药研发提供参考。

疫苗和药物治疗仍然是现阶段防控HPS的主要手段。但使用的传统灭活疫苗对不同血清型，甚至同一血清型不同菌株的野毒株保护效果不佳；新研制的由单个重组蛋白制备而成的HPS亚单位疫苗往往不足以提供足够的免疫保护力。因此，筛选多个免疫原性强的抗原蛋白、优化抗原蛋白生产的工艺和技术、筛选表现优异的免疫佐剂将是未来HPS疫苗研究的重要方向。