CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜中的应用研究进展

王 彤，高元鹏，韩 静，张景程，李喜和，何婷依，曹贵方*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018；2.西北农林科技大学 动物医学，陕西杨凌 712021；3.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010021)

转基因动物是指利用基因工程将外源基因整合到动物基因组或是对内源基因进行人为定向改造，修饰后的遗传物质可以稳定遗传给后代的动物。世界公认的第一例真正意义上的转基因动物是在1982年，Palmiter研究员利用原核显微注射的方式将人生长激素基因导入到小鼠原核胚胎中所构建[1]。1985年，Hammer研究员同样利用原核显微注射法成功获得了转基因家畜[2]。尽管使用原核显微注射技术来制备转基家畜效率较低，但是由于操作直观、结果可靠等优点一直被视为转基因动物生产的常规操作。

1996年，Campbell研究人员利用体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)成功获得了克隆羊[3]。1997年，Wilmut研究员利用SCNT等操作成功获得体细胞克隆羊“多莉”，这使得在体细胞上进行基因编辑，再结合SCNT来获得转基因动物成为可能。由于在自然条件下体细胞同源重组效率极低，再加上SCNT效率也较低[4]，利用SCNT建立的动物经常会发生猝死或引发与健康相关的并发症，所以只有有限数量转基因家畜被报道。

人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)的出现不但显著提高了转基因动物的生产效率，而且使得精准打靶成为可能。EEN主要是由锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9系统组成。其中CRISPR/Cas9基因编辑系统相对于其他两种系统来说结构简单、效率高、应用范围广和成本低，被广泛应用于转基因动物的建立上。

2006年利用转基因山羊生产的ATryn获得上市许可，这是世界首例获得上市许可的利用转基因山羊乳腺反应器生产的基因工程蛋白药物。2015年FDA批准转基因三文鱼上市，2017年转基因三文鱼登上加拿大的餐桌，这是全球首次批准可食用的转基因动物。2020年12月14日FDA批准了敲除猪细胞表面α-半乳糖(Alpha-gal)蛋白酶的转基因猪-GalSafe上市，这是首次获得批准的既可以用于人类食用也可用于人类医疗的转基因家畜，这也是科学创新伟大的里程碑。由此可见，未来会有越来越多的转基因动物制品以及转基因动物被允许上市，这也极大的鼓舞了科研人员对转基因动物研究的信心和热情。

本文主要综述CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜生产中取得的研究成果，并对其存在问题与未来发展进行讨论。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌抵抗病毒与噬菌体入侵的一种不断进化的适应性免疫防御机制[5]，该系统可以识别外源基因并对其进行切割，从而抵御其侵染。2011年Makrova等将CRISPR/Cas系统分为3种类型，分别为TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅由1个Cas9核酸内切酶就可以对DNA特定位点进行切割，组成成分相对简单，是目前研究最彻底的一种[6]。

CRISPR/Cas9获得性免疫保护机制主要有3个阶段，分别是CRISPR间隔序列的获得、CRISPR基因的表达和CRISPR干扰[7]。当外源基因入侵细菌时，CRISPR/Cas9通过前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)将候选的原间隔序列剪切插入到CRISPR序列前导区的下游并修复。当外源基因再次入侵时，CRISPR基因的表达水平迅速上升，转录生成前体CRISPR RNA(pre CRISPR derived RNA,pre-crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans acting CRISPR RNA,tracrRNA)，前者会被Cas蛋白剪切为成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)。最后，tracrRNA与crRNA通过碱基互补配对原则形成一条双链的RNA并与Cas9蛋白形成具有DNA内切酶活性的核糖核蛋白复合物crRNP。crRNP与外源的靶序列互补配对，并将Cas9蛋白引导至在PAM附近并对其DNA双链进行切割，从而降解外源DNA保护宿主细胞免受病毒与噬菌体的侵染。

2012年，Jinek将CRISPR/Cas9系统的tracrRNA以及crRNA人工融合为一条向导RNA(guide RNA,gRNA)，从而将CRISPR/Cas9系统进一步简化为只由一条单链向导RNA和一个Cas9核酸酶组成的系统[8]。针对DNA双链断裂(double strand break,DSB)，细胞主要通过非同源末端连接(non homologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous directed recombination,HDR)的修复方式进行修复。其中细胞主要是通过NHEJ修复途径来对DNA进行修复，但是会引入微小碱基的随机插入或缺失(small insert or delete,Indels)，这将导致基因组重要结构被破坏，或是因为移码突变从而过早形成终止密码子导致基因敲除(knock-out,KO)。HDR修复机制是在有修复模板存在的情况下对DNA进行精准修复，利用其原理可以实现基因组定点插入(knock-in,KI)，或是单碱基的替换。

2013年，张锋和Church等分别实现了CRISPR/Cas9基因编辑技术在哺乳动物的最早期应用。2015年麻省理工学院脑研究所联合哈佛医学院对CRISPR/Cas9系统进行改造，大大降低了该系统的脱靶效应[9]，从而提高了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行转基因动物生产的安全性。法国生物化学家Emmanuelle Charpentier和美国生物学家Jennifer Doudna更是因为对CRISPR/Cas9基因编辑技术做出的突出贡献，在2020年10月7日获诺贝尔化学奖，表明了CRISPR/Cas9基因编辑技术在科学领域不可替代的革命性意义。

2 CRISPR/Cas9基因编辑系统在猪的研究应用

2.1 在抗病转基因上的研究应用

猪是重要的农业经济动物，猪肉是人类动物蛋白的主要来源之一。随着全球人口数量的不断增加，猪肉需求量在逐日增长，全球养猪的规模在不断扩大，但是由于密集化饲养导致猪的新发和再发疫病也相继出现，从而给养猪行业造成了巨大的经济损失，针对抗病转基因猪品种的培育已经刻不容缓。目前研究人员主要是通过编辑宿主的受体，或是通过将抑制病毒增殖的基因插入到宿主的基因组的方法来抑制病毒。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术制备简单、效率高等优点，在猪的抗病育种中具有极大的潜力。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称为猪蓝耳病，是由于感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)所导致。PRRS会导致怀孕母猪早产或流产；新生仔猪虚弱、初生重较低、发烧咳嗽、生长性能下降；公猪厌食、嗜睡和精子质量下降等症状。PRRS每年都会给养猪行业造成巨大经济损失。2006年，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(high-pathogenic-porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)成为我国猪的主要流行病，HP-PRRSV起源于Ⅱ型的PRRSV，比传统的PRRSV具有更高的发病率与死亡率。研究发现CD163是PRRSV进入宿主细胞的关键受体基因，CD163全蛋白或是与病毒互作的SRCR5区的基因缺失可使基因敲除猪以及相应的宿主细胞对Ⅰ型和Ⅱ型的PRRSV分离株产生抵抗力。2018年，华南农业大学吴珍芳研究团队使用CRISPR/Cas9基因编辑技术与SCNT相结合，获得了CD163基因敲除的杜洛克猪[10]。试验进一步证明了敲除CD163基因的杜洛克猪可对HP-PRRSV感染具有完全的抵抗力，CD163的缺失并不影响巨噬细胞向单核细胞的分化和巨噬细胞对Hp-Hb的摄取。CD163基因敲除猪的构建为抵抗PRRSV提供了宝贵的实验动物。这是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物水平上进行基因组编辑来抵御病毒的感染，为以后研究病毒与宿主的关系提供了宝贵材料与思路。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种在家猪与野猪病死率高达100%的病毒性疾病，目前还没有有效的疫苗和治疗方法来抑制非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的感染。2018年，研究人员将靶向ASFV磷蛋白p30的CRISPR/Cas9基因编辑系统导入到病毒体内。由于靶向切割ASFV-p30基因组，所以导致由ASFV引起的空斑完全消失，并且病毒产量降低了4个数量级[11]。由此可见，利用CRISPR/Cas9靶向ASFV-p30是抵抗ASFV的一种有效的策略。核糖核酸酶L(RNase L)是受Ⅰ型干扰素调控的一种重要的抗病毒内切核酸酶，但是猪的核糖核酸酶L(sRNase L)的作用机制尚不明确。2019年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猪PK-15细胞系的sRNase L[12]。经研究发现，sRNase L具有多种生物学功能，包括降解细胞单链RNA、诱导细胞凋亡、下调干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的转录水平以及具有抵抗猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的活性，这一发现为生产PRV弱毒疫苗提供了宝贵的思路。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术直接对宿主细胞进行编辑，可用来研究病毒与宿主细胞之间的联系、病毒致病机理以及新型疫苗的构建。

2.2 在异种器官移植和疾病模型上的研究应用

家猪在生理学与解剖学方面与人类的器官有相似的特征。在人类器官短缺的情况下，家猪可以作为优良的供体动物为人类提供器官。但是猪与灵长类进行异种器官移植后会引起超急性免疫排斥反应、急性血管排斥反应和细胞介导的排斥反应和慢性排斥反应，并且猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)也阻碍着异种器官移植的发展。CRISPR/Cas9系统的简便高效性缩短了对家猪多基因人源化改造和对PERV编辑的时间，从而加速了猪与灵长类异种器官移植的发展与应用。

猪血管内皮上的α-Gal是由α1,3-半乳糖基转移酶(α1.3-galactosyltransferase，GGTA1)催化合成的细胞表面抗原。该抗原能被灵长类动物体内的抗体识别，从而引起超急性免疫排斥反应。2016年，研究人员使用CRISPR/Cas9基因编辑技术与SCNT获得了GGTA1双等位基因敲除猪，GGTA1的敲除降低了猪到灵长类所引起的超急性免疫排斥反应。然而研究发现，将敲除GGTA1转基因猪进行器官移植后，仍有抗体沉积、补体激活和血栓的形成。Byrne发现猪体内的β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)可催化合成SD(a)抗原，当移植到灵长类就引起免疫排斥。因此，将巴马猪的GGTA1和β4GalNT2基因敲除可以极大的降低其器官与组织的免疫原性。2019年，戴一凡研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马猪成纤维细胞系[13]。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可快速构建双基因敲除的细胞系，并为大量获得GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马猪打下基础。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可最大限度地降低对异种移植的抗体屏障，这些特异性抗原敲除猪的建立将扫除猪到灵长类异种器官移植的安全障碍，推动猪器官到临床的应用。

杨璐菡科研团队在猪异种器官移植上做出了突出贡献。2015年，杨璐菡首次鉴定出猪细胞内存在PERV完整谱系和在染色体上的拷贝数，并且证明了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以实现猪PK-15细胞系PERV的62个拷贝数的敲除，从而使人感染PERV风险下降至以前的1/1 000[14]。2017年，获得了100%敲除PREV的转基因猪1.0并取名为“莱卡”。2020年，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合转座子技术成功获得了敲除3种异种抗原同时插入9种人类基因的转基因猪3.0。转基因猪3.0已基本解决了免疫排斥问题，这是迄今为止最适合给人类捐献器官的转基因猪。

猪作为人类疾病模型动物是当下研究的热点，到目前为止利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了许多人类疾病模型猪。2015年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了敲除3个等位基因IGM突变的仔猪[15]，成功获得了免疫缺陷疾病模型猪。2016年，获得了敲除肿瘤抑制基因RUNX3的人类胃癌模型猪[16]。2017年，敲除巴马小型猪的载脂蛋白E基因和低密度脂蛋白受体基因，可以作为人类心血管疾病模型猪[17]，同年获得了敲除INS基因的糖尿病模型猪[18]。2018年，获得了亨廷顿模型猪，这为神经退行性疾病的发病机制和治疗研究提供了宝贵的模型动物。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以高效构建人类疾病模型动物，可更好地对人类疾病发生发展进行研究，从而为研制新抗病药物和治疗方案提供宝贵的动物材料。

2.3 生产性能的研究应用

2015年，吉林大学研究人员[19]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与有限稀释的方法获得了无筛选标记的敲除肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)的转基因猪，并在组织学上显示新生MSTN敲除仔猪的背最长肌存在较多的肌纤维核，表明MSTN基因在猪胚胎发育的过程中对肌纤维数量有一定的调节作用。2018年，研究人员[20]利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对巴马猪胰岛素样生长因子2(Insulin like growth factor 2,IGF2)的内含子3-3072位点进行编辑，结果表明，编辑非编码区也可以提高巴马猪的产肉量。这首次证明了编辑非编码区可以改善家畜的经济性状。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效地培育具有更高经济价值的转基因猪。

3 CRSIPR/Cas9基因编辑技术在牛的研究应用

3.1 在抗病转基因育种上的研究应用

牛抗病育种一直是转基因动物研究的热点。牛的结核病是由于牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)感染造成的一种人畜共患病。2017年，张涌院士团队[21]首次利用Cas9的突变体单切口酶(Cas9 nickase,Cas9n)，在牛的成纤维细胞精准插入外源NRAMP1基因，并成功获得了11头转基因牛。精准插入外源基因NRAMP1可以提高牛对结核病的抵抗能力，同时也证明Cas9n可以降低脱靶效率，提高转基因动物的生物安全性。牛副结核病是由于牛感染副结核分支杆菌(paratuberculosis,MAP)所引的，每年都会对奶制品造成巨大经济损失。研究发现白介素10受体α(interleukin-10 receptoralpha,IL-10RA)对MAP具有一定的免疫调节作用。2020年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了一株敲除IL10RA基因的牛乳腺上皮细胞。研究发现，敲除IL-10RA的牛乳腺上皮细胞可以降低促炎细胞因子信号转导负调控因子3(suppressor of cytokine signaling3,SOCS3)的表达，促进促炎细胞因子TNFA、IL-1A、IL-1B和IL-6基因的表达。敲除牛乳腺上皮细胞IL-10RA的获得有助于深入了解IL-10RA抗炎症的相关机制和MAP裂解产物作用机理，可作为评估不同抗炎药物抗炎效果的细胞模型。2020年，研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了敲除CD46基因的细胞系[22]。证明不同的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染性强烈依赖于CD46，而在敲除CD46的情况下，仍然有一部分病毒颗粒进入宿主细胞中。敲除CD46的细胞系获得，可用于阐明CD46受体在瘟疫病毒生物学和生长周期中的作用机制。

3.2 在早期胚胎动物模型上的研究应用

早期基因工程编辑效率低，再加上牛的生殖周期长，导致牛胚胎发育过程中很大程度上是未知的。OCT4对哺乳动物早期胚胎发育、细胞谱系分化和生殖细胞多能性的维持起着十分重要的作用，但是OCT4在牛囊胚形成和细胞谱系特性尚不明确。2017年，研究人员[23]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与SCNT获得了敲除OCT4的牛胚胎。研究发现，敲除牛OCT4的囊胚与敲除小鼠OCT4的囊胚的发育存在很大区别，但是与人类缺陷OCT4的囊胚发育相似。2018年，Bradford等[24]直接在牛的受精卵注射靶向OCT4基因的sgRNA与Cas9蛋白所组成的核糖核蛋白复合物，导致牛胚胎在第5天发育停滞，从而导致囊胚难以形成。敲除OCT4的牛胚胎可以为人类早期胚胎发育缺陷提供模型动物，也为牛的胚胎发育提供了宝贵的材料。转基因动物的获得主要是通过两种方式，一种是通过基因工程技术对体细胞进行编辑，然后通过SCNT获得转基因动物；另一种是将sgRNA-Cas9复合物显微注射到受精卵中，再通过胚胎移植的方式来获得转基因动物。但是，由于SCNT在培育健康克隆动物上效率比较低，再加上对操作人员的技术要求以及对仪器器材要求较高，并且通过SCNT构建的胚胎容易形成嵌合体动物。以上这些缺点都在制约着转基因动物的研究发展。2018年，研究人员[25]将靶向OCT4的sgRNA-Cas9所组成的核糖体复合物通过优化的电穿孔的方式转染到牛的受精卵中。研究表明，OCT4的编辑效率高达92%，大多数胚胎(11/13)呈现双等位基因编辑并且只有一个(1/13)胚胎发生了遗传嵌合体。利用电穿孔技术将CRISPR/Cas9系统导入到受精卵中，这种方法极大的降低操作难度，使转基因动物更加容易获得。

4 CRSIPR/Cas9技术在羊的研究应用

4.1 生产性能上的研究应用

羊是我国重要的家畜之一，为人类提供优质的肉制品、奶制品和毛制品。转基因羊具有生产更加优质的肉制品、奶制品和毛制品，也可以生产有经济价值的治疗性蛋白的潜力。2014年，首次证明了CRISPR/Cas9基因编辑系统可在山羊中应用，在3 d时间内可对所有内源性基因进行编辑，经过多重编辑的山羊可以在5个月内获得。CRISPR/Cas9基因编辑技术与SCNT相结合可快速获得转基因羊。

山羊奶具有高比例的脂肪和蛋白质含量并且在成分上也更加接近人乳，山羊奶已经成为牛奶的重要补充乳品。但是在山羊奶里的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是人类尤其是婴儿的主要过敏原，经过加热处理或发酵的方式都不能消除。2017年[26]，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了敲除BLG的转基因山羊。敲除BLG的转基因山羊奶中BLG蛋白浓度有所降低，为改良山羊奶的成分提供了新思路。2017年，南京农业大学研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了敲除BLG基因的同时，在BLG位点插入了人乳铁蛋白，从而消除了人对于山羊奶的过敏反应，并提高了山羊奶的营养价值[27]。

2014年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别在绵羊与山羊上获得了敲除MSTN双等位基因的转基因羊。2018年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除MSTN基因并在MSTN位点插入FAT-1基因的转基因山羊[28]。FAT-1表达上调可以增加ω-3多不饱和脂肪酸的含量从而降低n-6/n-3的比例，降低患神经疾病和癌症的风险[29]。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术加速了对绵羊与山羊在产肉性能上的改良。

随着生活水平的提升，人类对高品质羊绒的需求量也越来越高。成纤维生长因子(fibroblast growth factor 5,FGF5)和血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor， VEGF)是调控毛发生长的关键基因。2016年，陈玉林研究团队利用显微注射将靶向MSTN与FGF5的sgRNAs与Cas9-mRNA同时注射到山羊的胚胎中。试验证明，敲除FGF5基因可以增加毛囊数量和纤维长度，从而生产更多的羊绒。2020年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得5只敲除FGF5的杜泊羊[30]。敲除FGF5的转基因绵羊FGF5基因表达水平显著降低，且所有FGF5蛋白功能紊乱，在表型上毛囊密度与细毛度显著增加。这是首次建立FGF5、FGFR1、androgen、AR、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-myc和krts在内的下游信号通路。这些发现为进一步改善FGF5的功能、治疗雄激素性脱发提供了思路，也为培育产绒量高、绒纤维品质好的转基因绒山羊提供了宝贵的实验动物。

4.2 在其他方面的研究应用

褪黑素是一种重要的抗氧化剂，具有重要的营养和药用价值。2017年，研究人员[31]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术生产出富含褪黑素乳腺生物反应器的转基因羊。这是第1例表达AANAT和ASMT基因的模型动物，为大型转基因家畜的制作奠定了基础。2018年，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与SCNT相结合敲除了绵羊的囊性纤维化跨膜电导调节因子(transmembrane conductance regulator,CFTR)，敲除CFTR基因的绵羊出现了与人类囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)一致的临床症状。绵羊囊性纤维化动物模型的建立将成为研究人类CF有价值的疾病模型动物[32]。

5 讨论与展望

尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜的应用中已经取得令人瞩目的成果，但是由于酿脓链球菌Cas9(StreptococcuspyogenesCas,SpCas9)的高脱靶率、严格的PAM要求、高细胞毒性[33-36]的缺点，以及细胞发生HDR修复途径效率低[37]的因素，都限制其使用范围。

2018年，Charpentier等研究人员将Cas9与CtIP融合，可显著提高转基因的靶向整合效率。2020年，朱健康院士发现，经过磷酸化修饰和硫代修饰后的供体可极大地提高CRISPR/Cas9在水稻中介导的靶向插入效率，并且在此基础上，他们还发现在基因组上串联重复片段可以提高点突变效率。这些成果为提高CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜的靶向修复效率提供了可靠的试验依据与思路。

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对家畜基因组进行编辑时，会有一定的概率对非靶位点进行编辑。为了降低脱靶效应，有科研团队发明了单碱基编辑器系统，该系统在不产生DSB的情况下就可以发生单碱基替换，从而降低脱靶效应。此外，还有一种新CRISPR变异体，通过催化受损的Cas9蛋白核酸酶和逆转录酶融合而成，称之为prime editor。在不需要DSB或供体DNA模板的情况下，进行精确的靶向插入、缺失和点突变。这种方法可以有效地降低脱靶效应带来的副产品，减少对动物体的危害。

嗜热链球菌Cas9(StreptococcusthermophilusCas9,St1Cas9)是酿脓链球菌SpCas9的一个相对较小的同源物，它能够对不同种生物体内的基因组进行编辑，与SpCas9相比，它具有更低的细胞毒性、更高的特异性和更长的PAM要求。2020年季泉江研究团队与甘建华研究团队解析St1Cas9-sgRNA-DNA的三元复合物晶体结构，并揭示了HNH核酸酶结构域切割DNA的分子机制，同时也揭示了St1Cas9运用氢键和范德华力来识别较为复杂的NNAGAA的PAM序列。研究人员依据其分子机制进行定向进化，成功地将St1Cas9的PAM识别范围从野生型的NNAGAA拓展为NNRNAA，从而扩大了St1Cas9的基因编辑范围，使得St1Cas9在基因编辑系统具有更为广阔的应用前景。

综上所述，CRISPR/Cas9基因编辑技术在转基因家畜中已经取得了重大研究成果，随着技术的不断完善，CRISPR/Cas9基因编辑技术一定会在农业与人类医学中取得更多令人瞩目的成果。