耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶培养条件优化及酶学性质研究

张海娟，朱凤妹，李军

（河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛 066600）

黑曲霉（Aspergillus niger）分泌的葡聚糖酶在发酵上有一定的应用，最适pH值在4.0～6.0，最适温度一般在50℃～60℃[1]。在啤酒酿造中，葡聚糖酶主要在糖化工业中应用，麦汁糖化温度可以达到65℃～70℃[2]。在葡聚糖酶中，细菌来源的葡聚糖酶的热稳定性普遍低于真菌，而且最适pH值普遍呈中性[3]。纤维素酶由3种葡聚糖苷酶组成：内切葡聚糖苷酶（endo-1，4-β-D-glucanohydrolase，EG；EC 3.2.1.4），其负责纤维素纤维的无定形结构的内部区域的随机切割；纤维二糖水解酶（exo-1，4-β-D-glucanase，CBH；EC 3.2.1.91），主要作用于纤维素的结晶部分，催化纤维素纤维末端的葡萄糖或纤维二糖的释放；β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，BG；EC 3.2.1.21），其不直接作用于纤维素，不被认为是真正的纤维素酶[4-6]。EG是能够随机催化水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子分解成小段的纤维葡聚糖和纤维末端以及底物专一的一种胞外酶，EG中的谷氨酸为催化位点，同时预测天冬氨酸也为催化位点，加快催化反应[7]。

纤维素酶分解纤维素的过程中不可缺少内切葡聚糖苷酶的作用，近年来，内切葡聚糖苷酶已经在国内外开展大量的研究，但是耐热黑曲霉3.316菌种产生的胞外酶内切葡聚糖苷酶却并未研究[8]，3.316菌属于中高耐热菌，它的耐热性虽不如嗜热菌株，但是它在中高耐热菌中较稳定[9]。而且较以前研究的其它真菌产内切葡聚糖苷酶更全面，进行了盐浓度、表面活性剂等研究，发现表面活性剂能提高酶活性。对耐热黑曲霉产内切葡聚糖苷酶培养基优化和酶学性质的研究，不仅为纤维素酶的食品应用提供依据，同时为构建高效表达的基因工程菌提供了参考，还为蛋白质工程奠定了基础，目的是用于研究不同的食品工业化生产，此类研究正在进行中[10]。本试验通过单因素和响应面分析进行黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶发酵培养基条件优化及酶学性质测定，旨在提高内切葡聚糖苷酶活力，为进一步研究开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Aspergillus niger 3.316：中国微生物菌种保藏中心；小麦秸秆：江苏省连云港市东海县；硫酸铵：天津市风船化学试剂科技有限公司；微晶纤维素：天津市光复精细化工研究所；麦芽糖：天津市科密欧化学试剂有限公司。

种子培养基：FeSO4·4H2O 0.005 g，KCl 0.25 g，MgSO4·7H2O0.25g，K2HPO40.5g，NaNO31.5g，蔗糖15g，pH 6.5，蒸馏水 500 mL，121 ℃灭菌 20 min[11]。

基础发酵培养基 ：CaCl20.15 g，MgSO40.15 g，K2HPO41.0g，（NH4）2SO42.0g，麸皮15 g，蒸馏水500 mL，pH 5.5，121 ℃灭菌 20 min[12]。

1.2 仪器

FJS-4磁力搅拌水浴锅：金坛市城西富威实验仪器厂；YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDL-4台式离心机：台北市万方润华实验仪器厂；V-5100可见分光光度计：武汉高精密科学仪器有限公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱：苏州培英实验设备有限公司。

1.3 酶活力的测定

酶活力：以1.0 mL粗酶液1 min水解底物产生1 mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位。计算公式[13]如下。

式中：IU为酶活力，U/mL；M为还原糖含量，mg；t为反应时间，min；D为稀释倍数；Ew为粗酶液体积，mL；0.18 为 1 μmol葡萄糖的质量，mg。

酶活的测定方法参照李永博等[14]的方法进行测定。

1.4 单因素试验

1.4.1 碳源优化

分别以麸皮+玉米粉、玉米纤维、麸皮+玉米纤维、麸皮+葡萄糖、玉米芯、麸皮、葡萄糖、小麦秸秆、麸皮+小麦秸秆、玉米秸秆粉、麸皮+玉米秸秆粉为碳源，研究不同的碳源对发酵培养基的影响。

1.4.2 碳源浓度的筛选

分别以 10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/500 mL 为发酵培养基的碳源浓度，研究不同碳源浓度对发酵培养基的影响。

1.4.3 氮源的筛选

以酵母浸粉、硫酸铵、蛋白胨、氯化铵、尿素、硫酸铵+尿素（质量比1∶1）、硫酸铵+酵母浸粉（质量比1∶1）、硫酸铵+蛋白胨（质量比1∶1）为氮源，以未添加氮源为对照，研究不同的氮源对发酵培养基的影响。

1.4.4 氮源优化

分别以 1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 g/500 mL 为发酵培养基的氮源浓度，研究不同氮源浓度对发酵培养基的影响。

1.4.5 诱导物的筛选

分别以微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、水杨苷、乳糖、麦芽糖、空白、羧甲基纤维素钠+麦芽糖（1∶1）、微晶纤维素+羧甲基纤维素钠（质量比1∶1）、羧甲基纤维素钠+乳糖（质量比1∶1）、微晶纤维素+麦芽糖（质量比 1∶1）、微晶纤维素+乳糖（质量比 1∶1），微晶纤维素+水杨苷（质量比1∶1）为诱导物，研究不同的诱导物对发酵培养基的影响。

1.4.6 诱导物浓度的筛选

分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/500 mL 为发酵培养基的诱导物浓度，研究不同诱导物浓度对发酵培养基的影响。

1.5 发酵培养基的组分优化试验设计

选取小麦秸秆（A）、硫酸铵（B）、微晶纤维素+麦芽糖（C）为响应面的3个单因素变量，建立以内切葡聚糖苷酶（Y）为响应值的多元性回归模型方程。利用Design-Expert 8.0进行响应面试验设计和分析[15]。

1.6 4种酶理化性质的测定

1.6.1 温度对酶活力的影响及最适温度的测定

将 1 mL 粗酶液在 30、40、50、60、70 ℃的水浴锅中反应30 min后测定酶活。将粗酶液在50℃条件下保温1 h时间后，测定其剩余酶活力，确定温度对酶热稳定性的影响[16]。

1.6.2 pH值对酶活力的影响及最适pH值的测定

将1 mL粗酶液在50℃下反应30 min后，pH1～8时，测定其酶活。将粗酶液在50℃条件下保温1 h时间后，测定其剩余酶活力，确定pH值对酶稳定性的影响[16]。

1.6.3 不同金属离子对酶活力的影响

将1mL 粗酶液，分别加入 0.5mLKCL、NaCl、MnSO4、MgSO4、FeSO4、CuSO4金属离子溶液以及 0.5 mL 去离子水，保温1 h后测定其粗酶活。

1.6.4 不同浓度的盐溶液对酶活力的影响

将1 mL粗酶液和0.5 mL 0～10g/L浓度的NaCl溶液，在水浴锅中反应30 min后，测定其粗酶活。

1.6.5 不同浓度的表面活性剂对酶活力的影响

将1 mL粗酶液和0.5 mL 0～0.5g/L浓度的吐温-80，反应30 min后，测定其粗酶活[17]。

1.6.6 动力学常数-米氏常数Km值的测定

取6支比色管，分别加入浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的羧甲基纤维素钠作为底物，在最适温度、最适pH值的环境下反应，测定其酶活力[18]。米氏方程如下。

式中：V为反应速率，mmol/min；Vmax为最大反应速率，mmol/min；S为底物浓度，mol/L。根据米氏方程做Lineweaver-Burk双倒数图。

1.7 数据分析与处理

采用Microsoft Excel 2010表格绘图、SPSS 21软件、Duncan氏多重比较、Canoco for Windows 4.5、Design-Expert 8.0进行响应面试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源的确定

不同碳源对酶活力的影响见图1。

图1 不同碳源种类对酶活力的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on enzyme activity

选取单一物质和混合物质为碳源，图1结果表明小麦秸秆是黑曲霉产内切葡聚糖苷酶的最适碳源，同时小麦秸秆也是最普遍、低廉的物质，满足了工业上对廉价碳源的要求。

2.1.2 小麦秸秆浓度的确定

不同浓度小麦秸秆对酶活力的影响见图2。

图2结果表明，内切葡聚糖苷酶在浓度10g/500mL～15 g/500 mL时，酶活力上升，但是在15 g/500 mL～20 g/500 mL时，酶活力下降。小麦秸秆中含有丰富的糖物质，当糖达到一定量时，能够促进微生物生长产酶，但是当糖含量太高，反而抑制微生物的生长，从而影响产酶量。另外小麦秸秆的添加量过多，会影响微生物的通氧量，致使微生物不能呼吸而影响产酶结果。综上所述，选择15 g/500 mL为最适浓度并以此为响应面试验中心点。

图2 不同浓度小麦秸秆对酶活力的影响Fig.2 Effects of different concentrations of wheat straw on enzyme activity

2.1.3 氮源的确定

不同氮源对酶活力的影响见图3。

图3 不同氮源种类对酶活力的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

选用有机氮源和无机氮源，图3结果表明硫酸铵是黑曲霉产内切葡聚糖苷酶最适的氮源。

2.1.4 硫酸铵浓度的确定

不同浓度硫酸铵对酶活力的影响见图4。

图4 不同浓度氮源对酶活力的影响Fig.4 Effects of nitrogen sources at different concentrations on enzyme activity

图4结果表明，内切葡聚糖苷酶在1.5 g/500 mL～2.25 g/500 mL范围内逐渐增加，至2.25 g/500 mL浓度酶活力达到最大，2.25 g/500 mL～2.50 g/500 mL酶活力降低；氮源微生物生长必不可少的物质之一，若氮源含量过多，不利于蛋白质和氨基酸的合成，对菌体细胞物质有伤害。综上所述，2.25 g/500 mL为最适浓度并以此为响应面试验中心点。

2.1.5 诱导物的确定

不同诱导物对酶活力的影响见图5。

图5 不同诱导物种类对酶活力的影响Fig.5 Effects of different induced species on enzyme activity

选用单一诱导物和混合诱导物，图5结果表明，微晶纤维素+麦芽糖是内切葡聚糖苷酶最适合的诱导物。

2.1.6 微晶纤维素+麦芽糖浓度的确定

不同浓度微晶纤维素+麦芽糖对酶活力的影响见图6。

图6 不同浓度诱导物对酶活力的影响Fig.6 Effects of different concentrations of inducers on enzyme activity

图6结果表明，内切葡聚糖苷酶酶活力在0.5 g/500 mL～1.0 g/500 mL逐渐下降，在1.0 g/500 mL～2.0 g/500 mL上升，在2.0 g/500 mL～2.5 g/500 mL下降；诱导物能够影响结合蛋白，从而影响转录基因的表达，激发特定酶的合成，诱导物浓度高的话，会降低结合蛋白的形成，也就无法启动转录基因的表达。综上所述，2.0 g/500 mL为最适浓度并以此为响应面试验中心点。

2.2 中心组合试验结果及响应面分析

Box-Behnken试验设计：根据单因素试验结果，进行Box-Behnken试验设计[19]，试验因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 Box-Behnken试验因素及其水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Benhnken design

表2 中心组合设计及结果Table 2 Experimental matrix and results with central composite design

2.3 二次回归方程拟合及方差分析

以Y（内切葡聚糖苷酶的酶活力）为响应值的情况下，用中心组合设计（central composite design，CCD）程序进行多元回归分析，获得Y对A（小麦秸秆）、B（硫酸铵）、C（微晶纤维素+麦芽糖）的三元二次回归方程：Y=4.36-0.061A-0.019B+0.13C+0.042AB-0.013AC-0.097BC-0.32A2-0.25B2-0.20C2。回归模型和方差分析见表3。

由表3可知，Y回归方程的失拟检验P>0.05，差异不显著。总回归方程P<0.000 1，为极显著水平。证明了模型试验与实际试验拟合度很好，可以用于发酵试验的预测。在考察各个因素的相互作用时，可以看到差异极显著。由表3回归模型和方差可知，对内切葡聚糖苷酶酶活力的显著性影响为C、A显著性大于B显著性。小麦秸秆和微晶纤维素+麦芽糖各自作为碳源和诱导物，对产酶的影响极显著，硫酸铵作为氮因素，是简单的氮源，能促进细胞的生长和产酶量，影响也是显著的。不同因素间的影响不同，对产酶量的影响也不同。

表3 中心组合设计回归模型及方差Table 3 CCD regression models and ANOVA

2.4 响应因子的水平优化

各因素间交互作用的响应面图见图7。

由绘出的响应面图得出，通过三者的交互作用确定出最优点，每个图代表两个因素间的相互作用，此时第3个变量在中心水平位置[20]，内切葡聚糖苷酶酶活存在极值点，说明试验因素选取合理。由图7响应面立体图结果显示，当小麦秸秆含量固定不变时，酶活力随微晶纤维素+麦芽糖的增加呈现先增后减的趋势。小麦秸秆与硫酸铵的相互作用（图7a）影响极显著；小麦秸秆和微晶纤维素+麦芽糖的相互作用（图7b）影响不显著；硫酸铵和微晶纤维素+麦芽糖相互作用（图7c）影响极显著。

图7 各因素交互作用的响应面图Fig.7 Response surface map of the interaction of various factors

以小麦秸秆16.29 g/500 mL、硫酸铵2.24 g/500 mL、微晶纤维素+麦芽糖2.16 g/500 mL、CaCl20.15 g/500 mL、MgSO40.15 g/500 mL、K2HPO41.0 g/500 mL为发酵培养基，分5组进行发酵验证。内切葡聚糖苷酶酶活力为4.257 U/mL，与模型的误差值<3%。表明该模型能够很好地预测内切葡聚糖苷酶的发酵情况。

2.5 酶学性质

2.5.1 内切葡聚糖苷酶最适温度的测定

当作用时间、pH值不变时，在不同温度下，在恒温水浴锅中反应30 min后，得出结果如图8所示。

图8 内切葡聚糖苷酶最适温度Fig.8 The optimum tempera of endoglucanase

内切葡聚糖苷酶在30℃～60℃上升趋势相对缓慢，在60℃达到峰值，但在60℃～70℃下降趋势显著。由此说明，温度对内切葡聚糖苷酶活力影响较大，最适温度为60℃。

2.5.2 内切葡聚糖苷酶的热稳定性

粗酶溶液在 30、40、50、60℃和 70℃的水浴中温浴60 min，并测定残留的酶活性，以保温前酶活力为100%[21]，得出曲线如图9所示。

图9 内切葡聚糖苷酶热稳定性Fig.9 Thermal stability of endoglucanase

内切葡聚糖苷酶酶活力在30℃～50℃上升趋势相对缓慢，在50℃～70℃下降趋势显著，50℃时相对酶活力达到102%。由此说明，50℃时内切葡聚糖苷酶热稳定性最好。研究结果说明内切葡聚糖苷酶适合在较高温环境中发挥作用，并且热稳定性较强。

2.5.3 内切葡聚糖苷酶最适pH值的测定

通过试验分别测定了pH值为1～8时的酶活力，结果图10所示。

图10 内切葡聚糖苷酶最适pH值Fig.10 Optimum pH of endoglucanase

内切葡聚糖苷酶酶活力在pH值为1～3时，曲线呈上升趋势，pH3时相对酶活最大，pH值在3～8时，曲线持续呈下降趋势。由此可以得出pH值对于酶活力影响较大，随着pH值的逐渐升高，酶活力降低。

2.5.4 内切葡聚糖苷酶在不同pH值下的稳定性

内切葡聚糖苷酶在不同pH值下的稳定性见图11。

在如图11所示，pH值为1～5时，内切葡聚糖苷酶相对酶活力曲线持续呈上升趋势，在pH 5时，它的相对酶活力最大，达到原酶活的80%左右，在pH值为5～8时，曲线持续呈下降趋势，在pH值等于8时，达到原酶活的60%左右，即最低点。数据证明，在pH 5时，内切葡聚糖苷酶的稳定性最好。

图11 内切葡聚糖苷酶在不同pH值下的稳定性Fig.11 Stability of endoglucanase at different pH

2.5.5 不同金属离子对内切葡聚糖苷酶活力的影响

不同金属离子对内切葡聚糖苷酶活力影响见图12。

图12 不同金属离子对内切葡聚糖苷酶活力影响Fig.12 Effect of different metal ions on the activity of endoglucanase

本试验选取几种常见金属离子[22]，对照组和试验组在相同环境下试验，以对照组为最高酶活（100%），其余为相对酶活。酶蛋白的稳定性会在这种情况下被不同的金属离子所影响。通过与空白对照的对比，Na+、Mn2+对内切葡聚糖苷酶活力呈抑制作用，且Mn2+呈强抑制作用而 Na+则影响微弱。Mg2+、Fe2+、Cu2+、K+对内切葡聚糖苷酶活力呈促进作用，其中Cu2+、K+呈强促进作用而Mg2+、Fe2+则促进作用微弱。但总的来说，金属离子对内切葡聚糖苷酶活力的影响相对较小。

2.5.6 不同浓度的NaCl盐溶液对内切葡聚糖苷酶活力的影响

使用浓度分别为 0、2、4、6、8、10 g/L 的 NaCl溶液，在同样的环境下反应，以NaCl浓度为0的酶活力为100%，得出不同浓度的盐溶液对酶活影响，结果见图13。

图13 不同盐浓度对内切葡聚糖苷酶活力的影响Fig.13 Effect of different salt concentration on endoglucanase activities

由图13可知，在盐浓度为2 g/L的时候，相对酶活达到最大值92.96%，在6 g/L时，达到最低点，因其相对酶活都分布在90%左右，波动幅度较小，由此盐浓度对内切葡聚糖苷酶有较小的抑制作用。

2.5.7 不同浓度的表面活性剂对内切葡聚糖苷酶活力的影响

使用浓度分别为 0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐温-80，在同样环境、不同质量浓度的表面活性剂条件下，以吐温-80浓度为0%的试验组的酶活力为100%，测定其它浓度下的相对酶活[23]，结果见图14。

图14 表面活性力对内切葡聚糖苷酶活力的影响Fig.14 Effect of surface activity on activity of endoglucanase

由图14可知，当表面活性剂浓度为0.1%～0.2%时，相对酶活性上升，当表面活性剂浓度为0.2%～0.3%，相对酶活性降低；当表面活性剂浓度为0.3%～0.5%之间时，相对酶活性逐渐上升，但是相对酶活力都大于未添加表面活性剂的相对酶活力。说明表面活性剂促进了内切葡聚糖苷酶的活性。

2.5.8 内切葡聚糖苷酶动力学常数的测定

通过试验，使粗酶液在不同浓度的羧甲基纤维素钠溶液中，反应一定时间，测酶活力，得出不同浓度的底物对酶活影响[24]，结果见图15。

图15 不同浓度羧甲基纤维素钠为底物的内切葡聚糖苷酶动力学常数的测定Fig.15 Determination of kinetic constants of endoglucosidase with sodium carboxymethyl cellulose of different concentrations as substrates

由图15可知，根据米氏方程，即可得到1/V=5.86×1/S+277.46，Km=0.0211 mol/L，Vmax=0.003 6 mmol/min，当羧甲基纤维素钠浓度越大时，酶活力越大，反应速度越大。

3 结论

本研究通过单因素和响应面法对黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶的发酵培养基条件进行优化，优化的培养基使得该菌株产的内切葡聚糖苷酶酶活力强，性能优良。耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶结果表明：优化后的培养基组成为小麦秸秆16.29 g/500 mL，硫酸铵2.24g/500mL，微晶纤维素+麦芽糖2.16g/500mL，CaCl20.15 g/500 mL，MgSO40.15 g/500 mL，K2HPO41.0 g/500 mL。对酶学性质进行测定：内切葡聚糖苷酶适合在高温酸性环境中生存，同时Cu2+、K+有较大促进作用，表面活性剂对内切葡聚糖苷酶也有促进作用，同时羧甲基纤维素钠是内切葡聚糖苷酶的最适底物，得到这些性质后可以将内切葡聚糖苷酶更广泛的应用在食品中。同时也可在调控蛋白基因方面进行深度研究[25]。