葛根抗氧化活性有效部位的筛选研究

范琳，王苗，马馨桐，沈颖昕，韩荣欣，张红印，严铭铭，邵帅

（长春中医药大学，吉林省中药保健食品科技创新中心，吉林 长春 130117）

葛根为豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根[1]，是我国常见的药食同源植物，始载于东汉《神农本草经》[2]，具有解表退热、生津、透疹、升阳止泻等功效。现代研究表明，葛根中主要活性成分异黄酮类在维持心血管系统稳定性、保护脑神经、抗氧化、防止肝肾损伤、改善代谢与免疫功能等方面均有显著疗效[3-5]。因此，药用价值极高的葛根，有“亚洲人参”之美誉。2002年被国家卫生部正式批准为“药食同源”植物，其在抗氧化、辅助降血脂、辅助降血糖等功能性保健食品中均有应用[6-10]。目前，葛根抗氧化活性的研究主要是葛根素、葛根异黄酮类、葛根多糖、葛根多肽等，而对葛根各提取物和有效部位抗氧化活性组分进行筛选的研究较少。

研究表明，衰老、癌症、糖尿病和神经退行性等多种疾病都与过量自由基的产生有密切关联[11-13]，所以添加抗氧化剂或自由基清除剂能有效抑制或缓解自由基对机体的不利影响。化学合成的抗氧化剂，虽然效果好，但同时也带来了巨大的安全隐患。因此，从植物中寻求高效、安全的天然抗氧化剂成为研究热点。

因此，本试验对葛根提取物和萃取物进行活性成分含量测定，并以清除DPPH自由基、羟基自由基能力和总还原能力对各部位的抗氧化性进行评价，为研究和开发葛根抗氧化产品提供一定的理论依据。

1 材料

十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸乙酯、苯酚、铁氰化钾、冰醋酸、硫酸、甲醇：北京化工厂；正丁醇：国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；二苯代苦味酰基：SIGMAALDRICH公司；维生素C对照品（批号20191018，纯度为99.7%）：天津天泰精细化学品有限公司；邻菲啰啉、硫酸亚铁、香草醛：天津市光复精细化工研究所；中性氧化铝：上海陆都化学试剂厂；Amberlite-XAD-2大孔树脂：陶氏化学公司；无水葡萄糖：广东汕头市西陇化工厂；葛根素标准品、人参皂苷Re标准品：上海源叶生物科技有限公司；所用试剂均为分析纯。

AB256-S 型电子天平：METTLER TOLEDO；UV-1700型紫外-可见光分光光度计：HIMADZU；HH-6型数显恒温水浴锅：金坛市佳美仪器有限公司；KQ-205B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DT5-2B型低速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司。MFJ-W300粉碎机：北京利仁科技股份有限公司。

2 试验方法

2.1 样品制备

2.1.1 葛根不同提取物的制备

将葛根饮片粉碎，过100目筛，称取干燥粉末100g，分别以水、30%、50%、70%、95%乙醇为提取溶剂，回流提取3次，每次1.0 h，合并滤液，50℃减压浓缩，得葛根提取物浸膏，将所得葛根水、30%、50%、70%、95%乙醇提取物干燥，备用，体外抗氧化能力测定时配制成不同浓度的溶液。

2.1.2 葛根萃取物的制备

称取上述70%乙醇提取物适量，加适量蒸馏水溶解，加入等体积的乙酸乙酯与水层混匀进行萃取，分离乙酸乙酯层与水层，水层继续加入等体积水饱和正丁醇混匀，静置，分离水饱和正丁醇层和水层。上述萃取操作分别重复3～4次，合并收集各相萃取液，减压浓缩，干燥，即得葛根乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相萃取物，备用，体外抗氧化能力测定时配制成不同浓度的溶液。

2.2 总黄酮、总皂苷、总多糖含量测定

2.2.1 总黄酮含量测定

参照魏凤华等[14]总黄酮含量测定方法，以葛根素为对照品，乙醇为空白。根据葛根素标准曲线，计算样品中总黄酮含量是以每克提取物中含有相当于葛根素的毫克数来表示（mg/g）。

2.2.2 总多糖含量测定

参照文献[15]，以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法进行总多糖含量测定，结果以每克提取物中含有相当于葡萄糖的毫克数来表示（mg/g）。

2.2.3 总皂苷含量测定

参考文献[16]，以人参皂苷Re为对照，采用比色法检测待测样品中总皂苷的含量。结果以每克提取物中含有相当于人参皂苷Re的毫克数来表示（mg/g）。

2.3 体外抗氧化能力测定

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定

取不同葛根提取物和萃取物溶液2 mL于试管中，加入2 mL浓度为0.004%的DPPH溶液，混匀于暗室反应30 min，在517 nm处测定吸光度值A1；空白组用2 mL蒸馏水代替葛根提取物或萃取物溶液，测定吸光度值A0；样品对照组用2 mL甲醇代替DPPH溶液，测定吸光度值A2。以甲醇作为空白调零，VC作为阳性对照组。清除率计算公式：清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100。

2.3.2 羟基自由基清除率测定

采用邻二氮菲法测定葛根提取物和萃取物对·OH的作用，以VC作为标准对照，取邻二氮菲溶液1 mL分别加于各试管中，再加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）2 mL，再加入不同葛根提取物和萃取物溶液1 mL，混匀后加入FeSO4溶液1 mL，混勺，最后加入H2O2溶液1 mL，混匀。于37℃水浴1 h后在536nm处测定吸光度值A1，用蒸馏水调零。以1mL蒸馏水代替样品液，测定吸光度值A2；以1 mL蒸馏水代替H2O2溶液，测定吸光度值A0。清除率计算公式：清除率/%=（A1-A2）/（A0-A2）× 100。

2.3.3 总还原能力测定

取不同葛根提取物和萃取物溶液2.5 mL于试管中，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS溶液和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，50 ℃水浴反应 20 min，冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，离心，取上清2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，摇匀，静置，在700 nm处测定吸光度值A1；以2.5 mL蒸馏水代替2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，其余步骤相同，测定吸光度值A2。以蒸馏水作为空白调零，VC作为阳性对照组。总还原能力（A）计算公式：A=A1-A2。

2.4 数据统计与分析

采用 Excel 2010、SPSS 20.0、OriginPro 2019 对试验所得数据进行统计分析、相关性分析及图像绘制。所有试验均进行3次重复，数据以均值±标准差表示。

3 结果与讨论

3.1 总黄酮、总皂苷、总多糖含量测定结果

本试验对葛根各提取物及萃取物中总黄酮、总皂苷、总多糖3种主要化学成分进行了含量测定，结果见表1。

表1 葛根各提取物和萃取物中总黄酮、总皂苷和总多糖的含量Table 1 Contents of total flavonoids，total saponins and total polysaccharides in Pueraria lobata extract

由表1可知，水提取物与乙醇提取物相比，葛根总黄酮类成分主要存在于乙醇提物中，其中70%乙醇提取物中总黄酮和总皂苷成分含量最高，分别为326.1 mg/g和26.8 mg/g。总多糖成分则主要存在于水提物中，含量为183.9 mg/g，其次存在于70%乙醇提取物中。从简化制备工艺方面考虑，葛根用70%乙醇提取可以将其有效成分充分提取。

将葛根70%乙醇提取物水溶液加入乙酸乙酯进行萃取后，其总黄酮和总皂苷成分转移至乙酸乙酯相中，含量分别为535.6 mg/g和71.5 mg/g，比70%乙醇提取物中含量增高，可知皂苷和黄酮类物质更易溶于乙酸乙酯中，而葛根乙酸乙酯萃取物中总多糖含量与70%乙醇提取物中所测得值相比明显降低，可知多糖类物质不易溶于乙酸乙酯。由以上分析可知，70%乙醇提取物采用乙醇乙酸乙酯萃取的分离效果明显。再进一步以正丁醇进行萃取，对所得正丁醇萃取物进行活性成分含量测定，与70%乙醇提取物相比总皂苷在正丁醇中含量也增大，为51.2 mg/g。多糖类物质在正丁醇及水相中含量明显升高，含量分别为303.2 mg/g和319.0 mg/g。由此可知，乙酸乙酯和正丁醇作为70%乙醇葛根粗提物的萃取剂是良好的选择，可明显提高葛根有效物质的含量。

3.2 体外抗氧化活性测定结果

3.2.1 葛根不同溶剂提取物体外抗氧化活性测定结果

以清除DPPH自由基、羟基自由基能力及总还原能力考察葛根不同溶剂提取物（浓度1.0 mg/mL）的体外抗氧化活性，其结果见图1～图3。

图1 DPPH自由基清除能力Fig.1 Scavenging ability of DPPH free radicals

由图1～图3可知，葛根不同溶剂提取物均有明显的清除DPPH自由基的能力，其中70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力明显高于其他提取物的清除能力。葛根醇提物均具有明显的清除羟基自由基的能力，其中70%乙醇提取物的羟基自由基清除能力明显高于其他提取物。葛根不同溶剂提取物均具有可观的总还原能力。配制浓度为1.0 mg/mL的葛根水提物，30%、50%、70%、95%乙醇提取物溶液，测定总还原能力，结果70%乙醇提取物的总还原能力最高。因此，进一步对70%乙醇提取物进行抗氧化活性比较。

图2 羟基自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability of hydroxyl free radicals

图3 总还原能力测定结果Fig.3 Results of total reducing ability

3.2.2 70%乙醇提取物萃取物体外抗氧化活性测定结果

70%乙醇提取物萃取物体外抗氧化活性测定结果见图4～图6。

图4 清除DPPH自由基能力测定结果Fig.4 Results of DPPH free radicals scavenging ability

由图4～图6可知，70%乙醇提物经萃取后清除DPPH自由基能力最优者为乙酸乙酯萃取物，其次为正丁醇萃取物。对各萃取物羟基自由基清除能力进行测定，各萃取物均有明显的清除羟基自由基能力，且随浓度增加，清除能力逐渐增大，其中乙酸乙酯萃取物对羟基自由基清除率最高，其次为正丁醇萃取物，可能与其中总黄酮含量较高有关，与DPPH清除能力大小顺序相当。由此可证明上述选择的萃取剂是正确的，之后对其70%乙醇提取物的萃取物进行总还原能力测定，随浓度增加，总还原能力逐渐增大，其乙酸乙酯相的总还原能力最强，其次为正丁醇相。

图5 羟基自由基清除能力结果Fig.5 Results of scavenging ability of hydroxyl radicals

图6 总还原能力测定结果Fig.6 Results of total reducing ability

3.3 抗氧化能力与总黄酮、总皂苷、总多糖含量的相关性分析

抗氧化能力与总黄酮、总皂苷、总多糖含量的相关性分析见表2。

由表2可知，总黄酮的含量与DPPH·清除能力、羟基自由基清除能力有明显的相关性，且其数值对比其他部位来说最大，总皂苷的含量与抗氧化活性的相关性其次，总多糖含量与抗氧化活性相关性最低。由此可知葛根抗氧化能力与总黄酮的含量息息相关。总还原能力与总黄酮含量相关系数最大，与总多糖的含量相关系数最小，与DPPH·清除能力和羟基自由基清除能力的相关性分析结果一致。

表2 样品中总黄酮、总皂苷、总多糖含量与其DPPH·清除能力、总还原能力和羟基自由基清除能力的相关性分析Table 2 Correlation analysis of total flavonoids，total saponins，and total polysaccharides in samples with their DPPH free radicals`scavenging ability，reducing ability，and hydroxyl radical scavenging ability

3.4 抗氧化能力的IC50值和总还原能力的A0.7值

葛根各萃取物DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力的IC50值和总还原能力的A0.7值见表3。

表3 DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力的IC50值和总还原能力的A0.7值Table 3 DPPH scavenging ability，hydroxyl radical scavenging ability on IC50values and iron ion reduction ability of A0.7value

由表3可知，乙酸乙酯萃取部位在抗氧化活性中IC50值最小，其次为正丁醇萃取部位。葛根70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中含有大量总黄酮（535.6 mg/g），可以推测葛根中抗氧化能力最强的成分为黄酮类物质。

4 结论

葛根作为一种药食同源类植物，有很高的食用价值。本试验以葛根为原料，通过3种不同方法检测葛根各提取物和萃取物的抗氧化活性并测定其总黄酮、总皂苷和总多糖含量。结果表明，葛根70%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性明显高于其它，且其中总黄酮含量也为最大，正丁醇萃取物次之，但仍有良好的抗氧化活性。由相关性分析结果得知总黄酮含量与3种抗氧化活性的相关性最大。葛根中乙酸乙酯萃取物中总黄酮含量高达535.6 mg/g，是抗氧化活性的最优活性部位。由此可见，通过研究葛根乙酸乙酯萃取物结构与生物活性效应关系，进一步研究其单一化合物成分并探讨其发挥抗氧化作用的机制可对后期提取分离工艺提供一定的参考。