橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究

孙美君，孔杭如，赵珈莹，张伊瑾，林丽颖，郭东北，李蕾*

（1.厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102；2.中粮营养健康研究院，北京 102200）

辐射可以诱导细胞产生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），破坏生物大分子，抑制抗氧化酶活性，增加脂质代谢产物，使机体处于氧化应激状态，从而诱发细胞凋亡、坏死[1]，导致机体出现急、慢性损伤。橄榄叶是橄榄的副产品之一，含有橄榄苦苷、类黄酮等多酚类生物活性物质[2-4]，具有抗氧化[5-6]、抗肿瘤[7]、降血糖、降血脂[8]、消炎镇痛[9]等生物学功效，但其辐射防护作用未见报道。本研究采用超声辅助水提工艺[10]制备橄榄叶提取物（olive leaf extracts，OLE），并测定其多酚含量。将不同剂量的OLE灌胃给予小鼠后，采用X射线辐照小鼠，参考我国《保健食品检验与评价技术规范》中对辐射危害有辅助保护功能的评价方法，研究OLE抗辐射作用，初步探讨其作用机制，为橄榄叶的开发、利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橄榄叶：厦门凝赋生物科技有限公司；福林酚（批号J43737）、没食子酸标准品（批号149917）：上海金穗生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（批号 20191226）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号 20191225）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒（批号20191225）：南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红染色液（批号C0105S）、裂解液（批号P0013B）：碧云天生物技术公司；Bax抗体（批号AF0120）、Bcl-2抗体（批号 AF6139）：Affinity Bioscience公司；GAPDH 抗体（批号 AB0037）：Abways公司；羊抗兔二抗（批号GAR001）：杭州联科生物技术有限公司。

实验动物：BALB/c雄性小鼠（清洁级），购自厦门大学实验动物中心，合格证号[SCXK（沪）2017-0005]，体重18 g～22 g，饲养于厦门大学实验动物中心，温度（25±2）℃，湿度 50%～60%，12 h昼夜循环，自由进食饮水。

1.2 仪器

X射线生物学辐照仪（RS2000型）：美国Rad Source公司；全自动三分群血液细胞分析仪（BC-1800型）：深圳迈瑞公司；紫外分光光度计（T6型）：北京普析通仪器有限责任公司；石蜡切片机（RM2235型）、自动脱水机（TP1020型）、石蜡包埋机（EG1150型）、徕卡正置显微镜（DM4B型）：德国Leica公司；电泳仪（165-8033型）：美国Bio-Rad公司；超声仪（SK8200H型）：上海科导超声仪器有限公司；冻干机（LABCONCO-18型）：美国Labconco公司。

1.3 橄榄叶多酚含量的测定

1.3.1 橄榄叶提取物制备

参照文献[10]，称取10 g橄榄叶，加入200 mL水、0.125 g硼砂、0.2 g亚硫酸氢钠，混匀。超声辅助提取1 h，过滤，减压浓缩至 60 mL，按照 1∶1 的体积比，加入无水乙醇，4℃放置过夜。取上清液过滤、浓缩、冷冻干燥后得到OLE干粉，4℃避光保存。

1.3.2 橄榄叶中多酚物质含量测定

参考胡瑞云等[11]的方法，取20 mg没食子酸标准品加水溶解，定容至 100 mL，制备 0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的没食子酸工作液。取1.5 mL工作液，加入1.5 mL福林酚、2 mL 10%碳酸钠溶液，混匀，定容至25 mL。反应1 h，空白样调零，755 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。取制备的OLE粉末，乙醇溶解，定容至100 mL。量取0.5 mL，按没食子酸标准品测定方法操作，上机测定并记录吸光度值（OD）。

1.4 动物实验

1.4.1 样品配制

根据前期的研究结果，分别设置150、500、1 000 mg/kg 3个OLE剂量[12]。根据每组小鼠的平均体重，称取适量OLE，加水溶解，超声充分混匀，配制不同浓度的OLE水溶液。

1.4.2 实验动物分组

适应性饲养7 d后，将小鼠随机分为正常对照组，辐射对照组，低、中、高剂量OLE组，每组6只。低、中、高剂量OLE组分别灌胃给予150、500、1 000 mg/kg OLE，灌胃量0.3 mL。正常对照组与辐射对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续30 d。第31天，除正常对照组外，其余4组小鼠均接受一次性X射线全身均匀辐射，辐射剂量为1 Gy（剂量率为5 cGy/s，持续20 s）[13]。照射后 6 h～12 h内，眼球取血，分离血清，处死小鼠，取双侧股骨，剥离肝脏，液氮冷冻，-80℃保存备用。

1.5 观察指标

1.5.1 外周血细胞计数

采用全自动血液细胞分析仪检测外周血红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）、血小板（platelet，PLT）的数量。

1.5.2 血清氧化损伤指标测定

按照试剂盒步骤，采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定血清SOD活力；采用酶促反应测定血清GSH-Px活性；采用硫代巴比妥酸法测定血清MDA水平。

1.5.3 骨髓细胞微核实验

取小鼠双侧股骨，骨髓涂片，干燥后甲醇固定10min，取出晾干。苏木素-伊红染色液染色10 min～15 min，磷酸盐缓冲液冲洗，晾干，油镜观察、计数含微核的嗜多染红细胞。

1.5.4 Bcl-2与Bax蛋白表达水平测定

1.5.4.1 总蛋白浓度测定

将肝脏组织剪碎，每100 mg肝组织加入1 mL裂解液（含1%苯甲基磺酰氟），研磨提取蛋白。将提取的样品转移至预冷的离心管中，4℃离心取上清，-20℃分装保存。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度试剂盒测定肝脏总蛋白含量。

1.5.4.2 Western Blot实验

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法，按照蛋白样品与上样缓冲液体积比5∶1，加入上样缓冲液煮沸至变性。上样电泳，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入Bcl-2与Bax抗体（按体积比1∶1 000稀释），4℃振荡孵育过夜。用吐温20三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（tris buffered saline with tween 20，TBST）洗涤，加入羊抗兔二抗（按体积比1∶1 000稀释），室温（25℃～28℃）振荡孵育2 h，TBST洗涤后曝光显影。采用Image J软件分析蛋白表达水平。

1.6 统计学分析

数据采用均数±标准差表示，采用SPSS17.0进行单因素方差分析、最小显著性法进行组间比较，以检验水准α=0.05进行显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 橄榄叶中多酚的含量

没食子酸标准曲线见图1。

如图1所示，多酚（以没食子酸计）标准曲线为Y=29.817X+0.019 5（R2=0.999 2），且在0.001 mg/mL～0.025 mg/mL范围内线性关系良好。OLE的OD值为0.363±0.018，由标准曲线方程，最终得出橄榄叶多酚含量为（57.55±2.98）mg/g。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 OLE对辐射小鼠外周血细胞的影响

各组小鼠外周血细胞数量见表1。

表1 OLE 对小鼠外周血细胞数量的影响（±s，n=6）Table 1 Effects of OLE on peripheral blood parameters in mice（±s，n=6）

表1 OLE 对小鼠外周血细胞数量的影响（±s，n=6）Table 1 Effects of OLE on peripheral blood parameters in mice（±s，n=6）

注：a表示与正常对照组比较，P<0.05差异显著；b表示与辐射对照组比较，P<0.05差异显著。

组别WBC/（×109个/L）RBC/（×1012个/L）PLT/（×109个/L）正常对照组 2.48±0.34 6.81±0.31 422.50±12.39辐射对照组 0.60±0.12a 4.13±0.10a 258.00±7.37a低剂量组（150 mg/kg） 1.17±0.36a 4.42±0.27a 295.50±7.15a中剂量组（500 mg/kg） 1.50±0.43ab 4.58±0.28a 330.33±10.16a高剂量组（1 000 mg/kg） 2.10±0.16b 5.43±0.29b 366.00±10.26ab

与正常对照组比，辐射对照组小鼠WBC、RBC和PLT数量均显著下降（P<0.05）。与辐射对照组比较，中、高剂量OLE组小鼠WBC数量均显著升高（P<0.05），高剂量组PLT、RBC数量显著增加。

2.3 OLE对辐射小鼠血清抗氧化酶的影响

各组小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量见表2。

表2 OLE 对小鼠血清氧化损伤指标的影响（±s，n=6）Table 2 Effects of OLE on serum oxidative damage in mice（±s，n=6）

表2 OLE 对小鼠血清氧化损伤指标的影响（±s，n=6）Table 2 Effects of OLE on serum oxidative damage in mice（±s，n=6）

注：a表示与正常对照组比较，P<0.05差异显著；b表示与辐射对照组比较，P<0.05差异显著。

组别SOD活性/（U/mL）MDA含量/（nmol/mL）GSH-Px活性/（U/mL）正常对照组 135.68±22.85 5.65±0.73 544.76±37.42辐射对照组 73.92±10.29a 15.37±0.82a 383.81±31.89a低剂量组（150 mg/kg） 87.83±5.96a 13.74±0.51a 407.62±47.31a中剂量组（500 mg/kg） 101.27±12.77ab 13.25±0.63ab 441.90±27.73ab高剂量组（1 000 mg/kg） 110.42±16.73ab 10.67±0.40ab 485.71±21.88ab

与正常对照组相比，辐射对照组小鼠血清SOD和GSH-Px活性显著降低，MDA含量则显著升高（P<0.05）。与辐射对照组比，中、高剂量OLE组小鼠血清SOD和GSH-Px活性显著升高，MDA含量明显下降（P<0.05）。

2.4 OLE对辐射小鼠骨髓细胞微核的影响

各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率见图2。

图2 OLE对小鼠骨髓细胞微核的影响Fig.2 Effects of OLE on the micronucleus rate of mice

辐射对照组小鼠骨髓细胞微核率为（2.547±0.491）‰高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。中、高剂量OLE组小鼠的微核率分别为（1.860±0.274）‰，（1.233±0.290）‰，均显著低于辐射对照组（P<0.05），其中高剂量OLE组的骨髓细胞微核数较辐射对照组降低51.59‰。

2.5 OLE对小鼠凋亡蛋白表达水平的影响

Western blot电泳图与各组小鼠蛋白表达水平见图 3、图 4。

图3 Bcl-2和Bax蛋白Western blot电泳图谱Fig.3 Electrophoresis profiles of Bcl-2 and Bax protein

图4 OLE对小鼠凋亡蛋白表达水平的影响Fig.4 Effects of OLE on expression of apoptotic protein of mice

与辐射对照组相比，高剂量OLE组小鼠Bcl-2表达水平显著升高，Bax的表达水平显著降低（P<0.05）。说明高剂量OLE可有效调控小鼠肝组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。

3 结论与讨论

本研究测得橄榄叶中多酚含量为（57.55±2.98）mg/g。孔祥佳等[14]测得橄榄叶中多酚含量为（89.00±1.40）mg/g，高于本研究结果。而朱静平[15]发现卡林等不同品种橄榄叶中的多酚含量约为30.09 mg/g～35.87 mg/g，低于本研究结果。这可能与橄榄叶的种植区域、品种等不同有关。

辐射通过电离或激发体内水分子，产生大量的活性氧自由基，加剧脂质过氧化反应，使机体处于应激状态[16]。本研究结果显示，辐射可致小鼠血清中的SOD、GSH-Px活性显著下降，MDA含量增加。给予不同剂量的OLE后，小鼠SOD、GSH-Px活性升高，脂质过氧化反应减轻，且随着OLE剂量的增加，这种作用更为显著。提示橄榄叶酚类物质能够提高机体的抗氧化能力[17]，减轻辐射造成的氧化损伤。左丽丽等[18]研究发现，狗枣猕猴桃多酚能够有效抑制辐射小鼠肝、肾等脏器产生MDA，提高SOD、GSH-Px等酶的活性，减轻机体辐射氧化损伤，与本文结果一致。

造血系统是电离辐射最为敏感的系统之一[19]，外周血WBC、RBC、PLT的数量是反映受到辐射损害的造血干/祖细胞自我修复能力的指标[20]。本实验发现，辐射对照组小鼠外周血细胞明显降低，造血干细胞自我修复能力减弱，造血功能障碍。中、高剂量OLE组小鼠外周血细胞数量则显著升高，说明OLE能够减轻辐射造成的小鼠造血系统损伤，促进造血干细胞增殖分化，其作用机制可能与多酚能够降低造血干细胞内ROS水平、恢复造血系统功能有关[21]。金飞等[22]也证实辐射前给予小鼠葡多酚可以促进其造血系统恢复。

辐射容易造成染色体受损断裂，染色体断片在细胞分裂后期仍存留于细胞质中，凝缩形成微核。因此微核率常用来评价DNA的受损情况，以及机体的修复能力[23]。本实验发现，OLE能明显降低辐射小鼠的骨髓细胞微核率，且随着OLE剂量的升高，保护作用增强。这可能与OLE中含有的多酚物质能够有效清除自由基、减轻生物大分子的损伤、阻断染色体畸变有关。曹明富[24]研究发现茶多酚能够抑制辐射诱发细胞微核形成，具有抗辐射诱变的作用，与本研究结果相一致。

Bcl-2基因及其相关蛋白家族可调控多种刺激诱导的细胞凋亡。Bcl-2蛋白表达升高可抑制细胞凋亡，维持细胞正常存活；Bax蛋白表达增加则可加速细胞凋亡[25]。本实验中，辐射对照组小鼠抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低，促凋亡蛋白Bax表达水平升高，而高剂量OLE则可以有效逆转辐照小鼠凋亡蛋白的表达。提示OLE能够调控Bcl-2与Bax蛋白的表达，抑制细胞凋亡，减轻辐射诱发的细胞损伤。本结果与山楂多酚提取物可抑制紫外线诱发HaCaT细胞凋亡的研究结果[26]相一致。

综上所述，橄榄叶中多酚含量丰富，可有效提高辐射小鼠外周血细胞数量，减轻脂质过氧化损伤，抑制细胞凋亡，降低DNA损伤，对小鼠的辐射损伤具有良好的防护作用。