MAPKs信号通路在内皮素-1诱导的牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用研究

梁莉 许亦权 杨楠 王辰

[關键词]牙周膜干细胞;内皮素-1;丝裂原激活蛋白激酶;Runx2;骨钙素;牙周炎

牙周炎导致牙槽骨出现损伤，所以骨再生是牙周病诊治的重中之重。牙周膜干细胞（Periodontal ligamentstem cells，PDLSCs）作为骨再生的不可忽视的一大细胞[1]。干细胞参与骨再生过程，并且受很多因子影响，内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是多功能因子，在该疾病患者的牙槽骨吸收中起到了不可忽视的效用[2-3]。在之前实验中了解到ET-1经过丝裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）信号通路促进PDLSCs的成骨分化，但具体机制尚不清楚[4]。因此，本实验旨在研究MAPKs信号通路在ET-1调控PDLSCs成骨分化过程中的作用机制，为牙周炎患者骨组织修复再生提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂：内皮素-1（美国Abcam公司），α-MEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（FCS），胰蛋白酶（美国Gibco公司），Trizol（Invitrogen公司），Real-time PCR试剂盒（Takara公司），Western blot检测试剂盒及NC膜为Amersham公司产品。

1.2 体外分离PDLSCs细胞：使用13岁由于正畸原因而拔除的前磨牙患者牙齿，在无菌条件下用PBS反复冲洗牙根表面，收集牙根表面有牙周膜覆盖部分的牙周韧带组织，剪碎后用胶原纤维酶消化处理为单细胞悬液。用含FBS的α-MEM培养基培养1周左右，胰酶消化细胞。以每孔0.1ml的浓度将细胞接种于96孔板，隔天换液，1周左右后将具有克隆形成的细胞挑选出，标记为原代细胞。原代细胞继续接种于培养瓶中，待细胞融合至70%时，按照1：3的比例传代，取3～4代细胞进行实验。使用流式细胞仪对已经得到的细胞进行干细胞表面分子标志物测定过程。

1.3 细胞处理：牙周膜干细胞依照1×105/孔的密度在6孔板中进行培养，等待生长12h后，观察其贴壁情况，使用α-MEM培养基对其培养。次日将孔中的培养液吸出，添加新的培养液，之后在向培养孔中添加MAPK信号通路的三种通路抑制剂，ERK通路抑制剂PD98059，JNK通路抑制剂SP600125，p38α通路抑制剂SB203580。之后再添加100nMET-1，培养2周后，以未作任何处理的牙周膜干细胞为空白对照，以单独加入抑制剂的牙周膜干细胞为阴性对照，采用实时定量PCR和Western blot检测各组细胞Runx2和OCN的表达。

1.4 实时定量PCR检测：用Trizol法抽提细胞总RNA，按试剂盒说明进行反转录合成cDNA，用Primer Premier 5设计目的基因、内参基因GAPDH的引物，引物序列（见表1）。PCR扩增条件：95℃预变性30s;95℃ 5s，60℃ 34s，95℃15s，60℃ 60s，95℃ 15s。将GAPDH作为内参对照，将Runx2和OCN基因得值与样品内参基因得值进行相比，获得Runx2以及OCN基因相对mRNA表达量值。

1.5 Western blot检测：取对数生长期细胞，依照常规方法进行裂解，从而获得蛋白，去其上清检测其蛋白定量，使用浓度为12% SDS-PAGE凝胶电泳，将其蛋白转移到PVDF膜，TBST液洗涤印迹膜5min×3次。放入5%脱脂奶粉/TBST封闭液内，室温封闭1h。加入Runx2、OCN和GAPDH抗体，4℃过夜。弃一抗，TBST洗涤15分钟/次×3次。加二抗抗体，室温1h。最后ECL显色，X线压片曝光。

1.6 统计学分析：采用统计软件进行分析处理。实验数据以x?±s表示。组间比较采用单因素方差分析及LSD-t 检验。P <0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实时定量PCR结果：空白组与阴性组间比较差异无统计学意义（P >0.05）。与空白组和阴性组相比较，ET-1处理组、ET-1+SP组和ET-1+SB组牙周膜干细胞Runx2和OCN mRNA表达显著增强（P <0.05）;而ET-1+PD组牙周膜干细胞Runx2和OCN mRNA的表达没有明显变化（P >0.05）。与ET-1处理组相比较，ET-1+PD组牙周膜干细胞Runx2和OCN mRNA表达显著降低（P <0.05）。见图1。

2.2 Western blot检测结果：结果显示ET-1明显增强了PDLSCs组、PDLSCs+SP组和PDLSCs+SB组牙周膜干细胞Runx2和OCN蛋白的表达（P <0.05）;但对PDLSCs+PD组牙周膜干细胞Runx2和OCN蛋白表达没有显著影响（P >0.05）。见图2。

3 讨论

随着人口老龄化的到来，以及国民整体健康水平的提高，牙周健康越来越受关注。牙周炎是影响牙周健康的最常见疾病，会导致牙周结构（如牙槽骨、牙周膜、牙骨质）的破坏引起牙齿活动脱落，是成人牙齿缺少的重要因素[5]。牙周组织修复以及骨再生是这一疾病诊治的关键所在。

牙周膜干细胞（PDLSCs）是修复牙周组织最有潜力的成体干细胞[6-7]。其在骨组织修复中起到关键的作用，并且受多种因子所调控。内皮素-1（ET-1）作为日本研究人员从实验动物猪的主动脉内皮细胞中得到的一类血管活性肽[8]，研究表明ET-1可诱导成骨细胞形成新骨。ET-1可以刺激前成骨细胞的增殖分化，并通过膜蛋白-联接蛋白促进成骨细胞的分化。另外，ET-1可增加骨钙素和骨桥蛋白等基因的整合，刺激碱磷酶的释放和胶原酶的分泌[9]。ET-1不仅参与了牙周炎患者异常牙周组织改建的病理阶段，对牙槽骨的吸收也有着不可忽视的效用[10]。在之前的实验过程中发现ET-1可以促进了PDLSCs的成骨分化能力，而且MAPKs信号通路参与其中，但调控机制尚不清楚[4]。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作为丝/苏氨酸蛋白激酶的一种，在体内中有着很关键的作用，可以把信号从细胞表面将其传递到到核内，主要包含细胞外信号调控激酶1/2 （extracellular signal regulated kinase1/2，ERK-1/2）、c-jun氨基端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）及p38三部分[11-12]，这三种激酶共同介导着细胞的生长、增殖、分化、凋亡以及炎症等过程[13]。其中，ERK在细胞增殖和分化中发挥信号网络核心的作用。有学者研究发现ERK信号通路能够促进Runx2等转录因子的表达和活性从而促进成骨分化的进程。FGF-2、BMP-2、IGF-1等刺激因子可以通过ERK信号通路调控细胞的成骨分化过程[14-15]。

在本次实验中，添加ET-1后，PDLSCs的Runx2和OCN的表达程度和对照组相比明显提升，加入ET-1和ERK通路抑制剂PD98059后，Runx2和OCN的表达水平和只添加ET-1后发生了明显减少的情况，PD98059（ERK通路抑制剂）能够对ET-1诱导的PDLSCs Runx2和OCN表达水平产生抑制的作用，但SP600125（JNK通路抑制剂）和SB203580（p38α通路抑制剂）的抑制作用不显著。结果提示ERK信号通路参与了ET-1诱导的PDLSCs骨向分化过程。

因此，本研究发现ET-1通过ERK信号通路调控牙周膜干细胞的成骨分化能力，为牙周炎患者骨组织修复再生提供理论参考。