动物源生物活性肽研究进展

王 爽，刘雪松，徐 馨，吴 宪，张鹏宇，陈 曦，李 莉，江波涛

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005)

生物活性肽(Bioactive peptides，BAP)是一类具有生物学活性、能够对机体产生一定影响的肽[1]。早期研究认为，蛋白质的消化需要经过消化道各种酶类的水解，从而形成大量的氨基酸而被机体吸收利用。但是，随着研究的深入，逐渐发现以氨基酸的形式进行吸收只是蛋白质的吸收方式之一，更多的则是以短肽的方式被吸收。因短肽可以直接对生命活动进行调控，其吸收方式要优于蛋白质及氨基酸[2]。生物活性肽一般为2～5个氨基酸合成的短肽，也有10～50个氨基酸组成的多肽，随着研究的深入，开发了许多具有抗氧化、降血压、降血脂、抗疲劳以及免疫调节等功能的生物活性肽，对机体健康具有良好的调控作用。生物活性肽的来源较为广泛，包括了动物源以及植物源等。其中动物源的生物活性肽占据了重要的地位。动物源的生物活性肽一般来自于动物的肉类、血液以及组织等。因动物源的生物活性肽来源较为广泛、性价比较高，得到了市场的广泛认可。

1 生物活性肽的提取

1.1 酶解 酶解一般是从动物的血液、蛋、奶以及不同组织中提取生物活性肽的第一步。在蛋白质的氨基酸长链中，存在着一些不具备生物活性肽的多肽片段。经过酶解后，许多具有生物学活性的肽才能被释放出来，发挥功能[5]。常用的酶包括了胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等[6]。一般通过蛋白酶的水解作用，可将蛋白质中的长链变为短链。经过水解后的蛋白水解液，相比未经过水解的蛋白质，蛋白条带会显著减少，且蛋白大小会显著下降[7]。相比较于其他的提取方法，酶解具有价格便宜、化学试剂以及毒性物质残留少的优点被广泛使用在生物活性肽保健品的制备工艺中[8]。Young等通过利用酶解技术从大眼金枪鱼的肌肉中提取到了一种抗氧化的活性肽，通过试验发现提取的生物活性肽具有优良的抗氧化活性[9]。柳慧琴通过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解牛脊髓后，得到了抗氧化的牛脊髓肽[1]。马利华等采用木瓜蛋白酶和中兴蛋白酶的复合酶解方法，从鸭血中分离出来具有优良效果的抗氧化肽[10]。酶解因其多种优点，被广泛应用于生物活性肽的制备。

1.2 超滤 超滤是一种压力驱动的膜分离技术，通过超滤膜的表面微孔截流住大分子的溶质，而小分子的物质可顺利通过微孔[11]。通过超滤技术，可以对分子量不同大小的肽进行分离，从而确定不同分子量大小的肽的生物学特性。超滤在超滤膜的使用期限内，可实现长时间稳定的分离。在大规模的制备时，经常使用超滤膜。而在实验室的试验阶段，可以使用超滤管进行替代；超滤在生物活性肽的制备上应用也较为广泛。崔学超等采用超滤方法分离鹿血抗氧化肽提取液，得到了4种不同分子质量的鹿血抗氧化肽，通过不同肽段氧化自由基清除能力的测定，得出了分子量小于3 kD的肽段抗氧化性最强[12]。Nadalian等通过超滤的方法从肉鸡的鸡皮中获得了一种抗氧化肽，并确认具有良好的自由基清除能力[13]。叶孟亮通过对酶解后的牦牛骨胶原蛋白进行超滤，发现小于3 kD的组分表现出了较高的促成骨细胞增殖活性[14]。在一般情况下，超滤是为酶解后得到的肽段进行纯化的方法。可有效将酶解后的肽按照分子量大小进行分离，被广泛应用在生物活性肽的纯化中。

1.3 凝胶色谱 凝胶色谱法的原理是凝胶能够形成网状结构，根据样品的分子量以及形状差异，在网状结构中储备的时间不同，进而达到分离的目的[15]。凝胶具有分子筛的作用，不同的组分因分子粒径的不同，移动路程与洗脱时间不同而得到分离，从而可进行多肽相对分子量的分布以及分级分析[16]。凝胶色谱具有条件温和、样品破坏性小、分离效果好等优点，但单独使用往往效果不佳，常与其他分离纯化方法联合使用。凝胶色谱法中常用的添料为葡聚糖Sephadex G-25、Sephadex G-15以及大孔树脂等[17]。石菊芬通过凝胶色谱技术将羊胎盘胎通过葡聚糖Sephadex G-15分离后得到了4个组分，经过鉴定后F-2组分的抗氧化能力最强[18]。曾珍等通过凝胶色谱技术利用葡聚糖Sephadex G-25对猪骨中的肽进行了分离纯化，得到了猪骨源的免疫活性肽[19]。宋晓光等利用DA201-C大孔树脂对水蛭活性肽进行了纯化，发现其纯化效果优良[20]。周自福采用DA201-C大孔树脂对牡蛎水解物进行凝胶层析，从而获得了具有抗高血压的牡蛎生物活性肽[21]。

1.4 反相液相色谱 反相液相色谱法(RP-HPLC)是分离多肽的一种常用方法，其原理是利用多肽分子的疏溶剂或者疏水作用，非极性或弱极性的多肽分子会与非极性的固定相相结合，而这种结合会由于流动相的变化而发生下降，进而使溶质分子被洗脱分离[22]。液相色谱分为分析液相和制备液相，对生物活性肽进行分离的为制备液相。与凝胶色谱技术一样，反相液相色谱技术多与其他的技术相结合用于生物活性肽的分离与纯化。叶孟亮通过反相液相色谱技术对牦牛骨胶原蛋白肽进行了进一步的纯化，获得了较强的骨细胞增殖活性的肽[15]。刘东阳用反相液相色谱技术对马鲛鱼源的生物活性肽进行纯化，得到了抗氧化活性优良的活性肽[23]。

1.5 其他方法 除以上方法外，也有一些方法能够对生物活性肽进行分离纯化，如亲和层析、双水相萃取技术以及毛细管电泳等技术。但这些方法因对实验室设备要求较高以及操作复杂等问题，在生物活性肽的分离纯化技术中使用相对较少。

2 结构鉴定

2.1 电泳法 电泳技术是利用多肽的相对分子质量以及等电点的不同对其鉴定的方法，其中，最常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳法操作简单、速度快，可以迅速地了解制备的肽的大致信息，但电泳法只能了解肽的相对分子质量以及等电点，无法了解其具体序列[27]。刘丽君通过SDS-PAGE技术确定了酶解后的小于3 kD的骆血生物活性肽具有良好的抗氧化活性[11]。柳慧琴通过SDS-PAGE技术确定了牛脊髓蛋白分子集中分布在了18.5 kD，为接下来的牛脊髓源生物活性肽的分离与制备提供了依据[1]。电泳技术多用于生物活性肽结构鉴定的第一步，是了解生物活性肽结构的最基础的一种方法。

2.2 质谱法 质谱法(Mass spectrommetry，MS)是利用质谱仪器将肽轰击成离子和离子碎片，然后按照质荷比的不同对成分以及结构分析的方法。其中包括了电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、基质辅助激光解析电离质谱法(MALDI-MS)以及四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive)等[28,29]。马志鹰通过ESI-MS/MS对驼血源降血压以及降血脂肽进行了测序，确定了其分离纯化的生物活性肽的氨基酸序列[30]。张宝林对马鲛鱼鱼骨源的降血脂生物活性肽进行了质谱分析，确定了该种肽的氨基酸序列[31]。Wang等利用Q-Exactive质谱技术对鲭鱼源生物活性肽进行了分析，确定了具有抗氧化活性肽的具体序列[32]。

2.3 其他方法 对于生物活性肽的结构鉴定常用以上的两种方法，但是也有一些其他的方法可以进行生物活性肽的结构鉴定，其中包括了紫外/红外光谱法、核磁共振法以及圆二色谱法等。此类方法除了可以对生物活性肽的氨基酸进行测序以外，也可以对活性肽的二级结构进行测定[16]。

3 功 能

3.1 抗氧化 机体内脂质和蛋白质的氧化可以产生自由基，如果机体内的自由基过多，可能会对蛋白质以及DNA进行破坏，从而引发疾病[33]。研究表明，体内自由基过多会引发糖尿病、癌症以及痴呆等疾病。控制体内自由基在一个稳定的数量对机体的健康具有重要意义[34]。抗氧化生物活性肽可有效清除自由基。抗氧化的生物活性肽来源较为广泛，其中以动物来源较多[35]。一般采用体外化学法验证提取的活性肽抗氧化活性，其中包括了DPPH自由基清除测定、ABTS自由基清除测定、超氧阴离子自由基清除、羟自由基清除率以及亚铁离子螯合能力的测定。刘丽君从驼血中分离纯化出了具有抗氧化能力的生物活性肽，并通过了DPPH自由基清除试验以及亚铁离子螯合试验验证了其抗氧化活性[11]。崔雪超等从鹿血中分离出了具有抗氧化的生物活性肽，并通过亚铁还原能力以及DPPH自由基清除测定等方式，验证了该种肽的抗氧化能力[12]。

3.2 降血压 高血压是常见的慢性疾病，其可以增加心脏病以及中风等疾病的几率。血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE，EC 3.4.1.5.1)在血压调节系统肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)中起着重要作用[38]。在RAS中，ACE将血管紧张素Ⅰ裂解为有活性的血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ可以通过血管收缩进而引发高血压。在KKS中，ACE在激肽酶的C末端连续切割两个氨基酸，导致该血管扩张剂失效。因此，具有ACE抑制活性的生物活性肽可通过降低血管紧张素Ⅱ水平或者增加激肽水平来降低血压[39]。对于抑制ACE活性肽的考察方法分为体外和体内两种。体外法最常用的就是测定马尿酸法，它是基于ACE酶与底物马尿酰-组氨酸-亮氨酸(HHL)之间的反映生成马尿酸的原理，ACE活性与马尿酸的生成量直接相关，直接通过测定马尿酸的含量，从而评估ACE的抑制程度[40]。体内试验是使用动物模型的方式来验证对ACE抑制的活性。原发性高血压大鼠(SHR)和人体高血压有着相近的病例症状，一般用这个动物模型来进行体内的ACE抑制活性考察[41]。马志鹰在驼血中分离纯化出了降血压活性肽，并通过液相色谱测定马尿酸含量的方法对其所具有的抑制ACE活性进行考察[30]。张可佳在牡蛎中分离出了ACE抑制肽，并利用了SHR模型验证了该种肽抑制ACE的活性[42]。

3.3 降血脂 血液中的脂质包括了乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。如果血液中任何一种脂质成分非正常升高，则可能是高脂血症的前兆[30]。经过流行病学调查以及临床试验等都发现了高脂血症与心脏疾病的发生关系紧密。维持血脂含量在一个正常水平对于预防心脏疾病有着重要意义。现阶段，市场上出现的降血脂药物，价格昂贵并且有可能引发多种副作用。因此，研究人员逐渐研究开发降血脂的生物活性肽。对具有降血脂的生物活性肽活性的考察多使用的方法是HMG-CoA还原酶抑制方法。HMG-CoA还原酶是体内催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成二羟甲基戊酸(MVA)的关键酶，这一步是体内合成胆固醇的限速步骤，也是目前最主要的高血脂症临床药物的靶点[43]。杨玉英从蚕蛹中分离纯化了具有降血脂活性的生物活性肽，并通过HMG-CoA还原酶抑制方法验证了其降血脂功能[44]。江锟等从鲈鱼中分离出了具有降血脂活性的肽，并通过体外试验验证了其降血脂活性[45]。

3.4 免疫调节 免疫活性肽可以调节机体的免疫系统，调节自身免疫力，刺激机体的淋巴细胞增殖能力和吞噬细胞的吞噬活性，提高机体对外源有害物质和自身产生的老化凋亡细胞的抵抗清除能力[46]。根据免疫细胞的分类，免疫调节肽对免疫细胞的影响可以分为淋巴细胞、吞噬细胞、K淋巴细胞以及NK淋巴细胞。免疫调节肽也可以对多种细胞因子起作用，其主要调节TNF-α、IL-10、IL-2以及IL-6等细胞因子的分泌，达到对局部吞噬细胞的调节作用，从而发挥其免疫调节功能。付劢从鸡胚中分离出具有免疫调节作用的活性肽，并且将小鼠巨噬细胞RAW264.7给予活性肽验证其免疫调节活性，得出鸡胚活性肽具有良好的免疫调节能力[47]。张东东对中国林蛙皮肤抗菌肽体内免疫调节作用进行了研究，得出了源于中国林蛙皮肤分泌物的抗菌肽Temproin-CEa和chensinin-1b具有良好的免疫调节活性[48]。

3.5 其他 除了上述种类的生物活性肽以外，还有抗疲劳肽、降糖肽、神经活性肽、酶调节及抑制肽以及抗菌肽等。这些肽都能对维持机体健康起到良好的作用。

4 小结与展望

生物活性肽是近些年来研究较为热门的一个领域，由于其拥有着丰富的功能被广大研究者们以及市场所接受。动物源生物活性肽对维持机体的稳定与健康发挥着重要的作用。从动物血、骨头、皮肤以及不同的脏器中分离出来的生物活性肽具有良好的功能，并且具有安全以及高效的优点。因此，在食品行业、养殖行业以及化妆品行业中得到了广泛应用。目前，动物源生物活性肽的研究还有一些不足之处，如大多数生物活性肽为多肽混合物，未能够彻底进行分离与纯化，相应的机理研究不全，以及相应产品转化率较低等问题。应针对以上问题开展深入研究，向着高效、快速以及全面的方向发展，为动物源生物活性肽的研究提供新思路以及新的方向，为维持机体健康提供更多优良的产品。