结直肠扩张法诱导大鼠内脏高敏感模型制作概述

蒋慧灵,郑倩华*,赵映,张薇,侯雨君,谭玉,李瑛,蔡定均

(1.成都中医药大学针灸推拿学院,成都 610072;2.成都中医药大学研究生院,成都 610072)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种临床常见的慢性功能性肠病,以反复发作的腹痛,伴排便习惯改变和(或)粪便形状改变为主要临床表现。最新的研究表明,根据罗马Ⅳ标准,IBS全球总体患病率约为3.8%[1],就医疗费用及生活质量而言,IBS的全球影响也是不可忽略的[2]。目前研究表明IBS的发病与内脏高敏感、胃肠动力异常、脑-肠轴相互作用、肠道菌群紊乱及代谢异常、胃肠道感染与炎症、精神心理因素、遗传、肠道通透性增高等相关[3],内脏高敏是IBS重要的病理机制之一,其主要表现为引起内脏疼痛或不适的阈值降低,内脏感受器对生理性刺激敏感性增强及对伤害性刺激的反应性增强[4]。目前,内脏高敏常作为IBS的特征性指标[5],也是IBS临床症状的重要病因之一,因此研究出一套持续稳定、客观、可重复性好及操作简单的内脏高敏动物模型制备方法尤为重要。

现有IBS动物模型制作方法较多,如结直肠球囊扩张、病原体感染、炎性刺激物致炎、母婴分离及改变胃肠激素等方法[6],其中CRD以其模型内脏高敏感性持续稳定而应用最为广泛[7]。CRD通过采用机械刺激因素造成大鼠慢性内脏高敏,其模型特点为操作简单,结论可靠,模型内脏高敏感性明显增高且持续稳定,并且大鼠结直肠无明显病理改变。本文对CRD诱导的IBS内脏高敏模型的制备方法进行整理与分析,为建立更有效稳定的IBS内脏高敏动物模型提供研究思路,综述如下。

1 CRD基本操作步骤

将球囊蘸少许医用石蜡油以润滑后,轻柔地从大鼠肛门插入至结直肠,固定球囊,扩张球囊,维持一定时间,给予直肠腔内物理性的压力刺激,然后放气收回球囊。每次刺激前可先轻柔大鼠肛门,促使其排便,减少加压过程中大鼠排便对CRD的影响。采用连续多天多次的重复性机械刺激方式制作慢性内脏高敏感模型。

2 实验对象的选择

文献回顾发现,CRD主要采用清洁级大鼠作为实验对象,以SD大鼠[8-30]及Wistar大鼠[31-36]使用最多。其中以SD大鼠乳鼠使用频率最高,其次为SD成年大鼠。

2.1 大鼠乳鼠CRD模型制备方法

2000年,Al-Chaer等[26]首次通过CRD制备出慢性内脏高敏大鼠模型,该模型采用SD大鼠雄性乳鼠为实验大鼠。具体方法为:于大鼠出生后8~21 d给予结直肠球囊扩张刺激,期间乳鼠与母鼠不分笼。球囊采用血管成形术球囊(长20 mm,直径3 mm),通过注水(0.3 mL)的方式扩张球囊,保持球囊压力60 mmHg(1 mmHg=0.133KPa,用血压计测量)。每天2次,每次持续1 min,2次间隔30 min,在1 h内完成2次扩张。CRD结束后2周为休息期,即不进行任何刺激及操作。乳鼠出生后第26天与母鼠分笼。该模型大鼠乳鼠内脏敏感神经元兴奋性明显增高,同时结肠组织无明显可识别病理变化,符合IBS功能性肠病的病理特点。此后该造模方法在国际范围内广泛应用。

2.2 成年大鼠CRD联合其他因素模型制备方法

成年大鼠CRD多与其他刺激因素联合造模,使获得的模型更加稳定可靠。其他刺激因素包括:母婴分离、醋酸灌肠、束缚、番泻叶灌胃、夹尾刺激等。由于CRD模型内脏高敏感性稳定可靠,同时上述刺激因素单一,仅模拟IBS某一方面,如母婴分离较好地模拟IBS致病因素,但在模拟IBS胃肠道功能紊乱症状方面具有局限性。因此,上述刺激因素常自由组合使用,目前常用组合方式包括:母婴分离+醋酸灌肠+CRD、CRD+肢体束缚、番泻叶及冰醋酸灌肠+固定器束缚+CRD+夹尾刺激等方法。

陶丽媛等[16]采用CRD联合肢体束缚法成功建立IBS内脏高敏模型,选择8周龄SD大鼠造模。造模第1~14天,每天同一时间进行CRD,每天2次,连续2周;第10~14天,联合肢体束缚(限制肩、双前肢及胸部,不限制头部的活动);每次束缚持续2 h,连续5 d。该模型的内脏敏感持续性不如乳鼠期结直肠扩张,模型正常饲养至18周龄时,接受相同CRD刺激后内脏敏感性没有增高,反而低于8周龄时期,这提示大鼠内脏敏感性随周龄增加而下降,同时对相同刺激的耐受性也随周龄增加而提高。

李依洁等[28]采用番泻叶灌胃联合冰醋酸灌肠+固定器束缚、CRD+夹尾刺激,成功建立脾肾阳虚证腹泻型IBS模型。具体如下:选择4周龄SD大鼠造模,造模周期共4周。全周期(4周)予番泻叶浓缩剂灌胃,每次每只2.0~2.5 mL,每天1次;于造模前2周注入0.5%冰醋酸,剂量从0.2 mL开始,逐渐增加至0.5 mL,同时以大鼠固定器束缚大鼠,时间从0.5 h逐渐加至1 h;于造模后2周进行结直肠扩张,每次扩张持续3~5 min,每天2次,同时联合采用卵圆钳夹尾刺激。该造模方法以大鼠固定束缚、夹尾刺激联合CRD进行行为学应激,诱导肝郁因素;以番泻叶灌胃、冰醋酸灌肠进行化学性刺激,模拟脾虚因素,番泻叶及冰醋酸寒凉之物,极易损伤机体阳气,日久累及肾阳,最终出现脾肾阳虚证[28]。该方法以长周期、多种刺激因素模拟了IBS患者的病程演变,是较为理想的模型制备方法。

由于成年大鼠CRD造模时采用多种刺激因素(化学刺激、物理刺激及心理应激等)联合,刺激量本身较大,因此与乳鼠CRD模型相比,联合其他因素造模时CRD机械刺激量相应减少,其扩张频率及扩张持续时间均缩短。

3 CRD之间的差异

3.1 压力的产生

3.1.1 球囊种类

目前CRD模型常用的球囊主要有以下几种:经皮冠状动脉成形术球囊 (PTCA球囊)[10,12-14,17-18,20,26]、血管成形术球囊[16-17,21,25,32,36]、人血管重建气囊[8,11,15,22,25,30]、双腔儿科导尿管(6F)[9,28,32-34,36]、一次性无菌双腔导尿管(8F)[16,24]及自制球囊[19,23,27,29,31,35]。其中因PTCA球囊延展性好且不易破裂最常用。

3.1.2 球囊插入深度

目前CRD模型的球囊插入深度差异较大,尚未有明确统一的标准。查阅现有文献发现,对球囊深度的描述包括定位、根据球囊大小确定深度及具体深度三类。如球囊插入至结直肠[14];将人血管重建气囊(2 mm×2.5 mm)全部插入[8,30];插入距肛门2~3 cm[9,28,32]、1 cm[16]。由于各模型选择的球囊不同,以及实验动物年龄的差异,因此球囊插入深度差异较大,从2 cm变化至7 cm,若不考虑球囊种类,仅从插入深度来看,插入深度大致分为3类:2 cm[19,23]、 3 ~ 5 cm[17,24,27,29,34-35]、 6 ~ 7 cm[9,29,31,36]。其中3~5 cm最常用,由于该长度球囊刚好达到大鼠的结肠部位。

3.1.3 扩张持续时间

多数模型的建立均参照Al-Chaer等[26]的方法,每次扩张持续1 min,少数采用30 s。若重复多次,则每次间隔30 min或5 min[9]。若扩张持续时间过短,模型的内脏高敏性不明显,模型制备不成功;如果扩张持续时间过长,易引起肠道粘膜局部缺血,导致造模失败。

3.2 压力的检测

3.2.1 扩张压力值的选择

目前压力值主要有两类:固定型及阶梯式渐进型。固定型压力值主要采用Al-Chaer等[26]方法的压力值,即60 mmHg,使用频率最高。阶梯渐进型即扩张压力随着大鼠年龄的增加而增加,以避免乳鼠结直肠损伤甚至死亡,降低其他因素对模型的影响,提高造模成功率。李延青等[35]发现由于乳鼠周龄较小,在进行CRD刺激时,易造成乳鼠内脏损伤甚至死亡。因此,李延青等[35]选择8日龄及15日龄Wistar大鼠,在进行CRD之前,提前确定乳鼠结肠刺激的最适压力,以减少实验偏差及乳鼠死亡数量,最终确定8日龄大鼠结肠刺激压力为30 mmHg(弱刺激组)、45 mmHg(强刺激组),15日龄大鼠结肠刺激压力为60 mmHg。同时在造模时根据大鼠年龄选择压力值,大鼠出生后8~14 d选择30 mmHg(弱刺激组)及45 mmHg(强刺激组),大鼠出生后15~21 d选择60 mmHg。结果显示30 mmHg与45 mmHg两组之间均造成慢性内脏高敏且实验结果无明显差异,这提示应用CRD造模时,可以选择最小压力刺激,仍可以造成慢性内脏高敏性,同时可降低死亡率。唐影[15]在大鼠出生后8~10 d予以40 mmHg,11~12 d予以60 mmHg,13~14 d予以80 mmHg,避免了早期过高的压力对乳鼠结直肠造成的机械性创伤(如出血、破裂等)。

3.2.2 压力测定仪器的选择

压力测定仪器以血压计[8,21,25,29-31]、压力泵(计)[35]和检压计[11,15]为主。

3.3 CRD刺激频率与周期

目前进行CRD的周期主要有两大类:连续性CRD刺激和间断CRD刺激。连续性CRD刺激指每天进行CRD刺激,每天1次[10-12,14-15,18,21-22,24,30]、2次[16,19,20,26,28,31]或3次[9,34,36]。 如大鼠出生后第8~21天[17-21,23,32],持续2周;出生后第8 ~ 14天[11,15,35]或第15天[8,22,25],持续1周左右;间断CRD刺激指间隔固定天数(一般间隔2 d)进行CRD刺激,如出生后在第8、10、12天或第14天[10,12-14]给与刺激。连续性CRD刺激刺激量较大,其模型内脏高敏性更加持续稳定,但连续的CRD刺激易造成大鼠结直肠病理损伤,如粘膜破损等,动物死亡率较高[35]。间断CRD刺激给予实验动物一定的休息期,刺激量较小,不易对大鼠结直肠粘膜造成损伤,不易造成动物死亡,但其内脏高敏性持续时间较短,因此间断CRD刺激常与其他刺激因素联合,以增加造模成功率。

4 模型评价指标

目前主要采用腹壁撤退反射[37]及腹外斜肌放电检测[8,11,15,25]评价模型内脏高敏感性;采用一般情况[9,14,28,31,32]、粪便情况[11,26,30]及肠道动力检测[12,17,18,21,32]评价模型胃肠道紊乱症状及粪便情况;采用结直肠组织病理学[18,19,21,22,24,25,28,30-32,35]评价模型结直肠组织情况。

5 讨论

CRD方法操作简单,无需麻醉,重复性好;且造模后内脏高敏性持续稳定。乳鼠CRD后出现慢性内脏高敏,且可持续至其成年。CRD造模后动物可出现毛发干枯毛躁,粪便性状改变等,且肠道无明显炎症等器质性的病理学变化,符合IBS的长期慢性病程及临床症状,也符合IBS属于功能性肠病的特点。

CRD通过直肠腔内扩张产生的机械刺激因素直接作用于结直肠平滑肌细胞,引起肠道内外周感受器敏感性增高,从而导致脊髓背角神经元兴奋性增加,产生痛敏化反应,引起中枢神经系统对伤害性刺激传入扩大化并产生记忆,从而引起模型慢性内脏高敏感性持续存在[38]。由于新生期接受反复的CRD刺激,导致结肠粘膜基础离子转运增加,可能直接导致肠腔内含水量增加,同时长期的CRD刺激会引起平滑肌过度收缩,从而导致新生期乳鼠成年后大便疏松、水样便增加,且结肠内无明显炎症及组织学变化。因此,乳鼠CRD被认为是IBS-D的合适模型[2]。Al-Chaer等[26]研究发现成年大鼠进行CRD刺激不会产生慢性内脏高敏,可能的解释是新生儿期神经系统与成年期神经系统相比拥有长期可塑性。因此,以成年大鼠为实验对象的CRD造模法,多采取联合其他刺激因素的方式使慢性内脏高敏性持续且稳定。

单一的刺激因素如母婴分离、醋酸灌肠、束缚、番泻叶灌胃、夹尾等仅模拟IBS病因症状等某一方面,均有一定的局限性。如夹尾能较好地模拟IBS致病因素及胃肠道功能紊乱症状,但其模型内脏高敏性持续时间较短,在模拟IBS慢性病程方面具有局限性[39];醋酸灌肠可致腹痛腹泻等临床症状,但模型结直肠组织可见炎症粘连[40];慢性束缚应激为非损伤应激且接近人的心理应激[41],但易对实验动物产生耐受。CRD模型内脏高敏性稳定可靠,但其在模拟IBS致病因素等方面具有局限性。因此,CRD联合其他刺激因素可以较全面地模拟IBS病因、病机、临床症状等方面,从而获得稳定可靠的模型。

当然CRD也有一定的局限性,如采用乳鼠作为对象进行造模时,因乳鼠周龄较小,机体各系统较脆弱,操作难度大,且造模周期长,死亡率较高。对于成年鼠,由于采用单一CRD造模稳定性欠佳,内脏高敏持续性不如乳鼠,所以往往联合其他刺激因素进行造模。刺激因素的增加,导致不可控因素增加,使得造模操作难度加大。目前CRD尚未有统一的操作标准,在采用的球囊种类、扩张压力、造模周期等方面均存在较大差异。这些差异可能是由于实验所选择的动物年龄、以及所涉及临床亚型不同所造成;也有可能是CRD的广泛应用,研究者们在最初CRD造模方法基础上不断改进,从而产生的差异。

目前CRD与中医辨证相关研究较少,笔者阅读文献后发现,在模拟IBS中医证型方面多采用联合其他刺激因素造模,母婴分离、束缚及夹尾等刺进模拟致病因素,产生行为学应激,诱导肝郁因素;番泻叶灌胃联合冰醋酸灌肠,番泻叶及冰醋酸均为寒性之物,损伤脾阳,日久及肾,肾阳亦不足;CRD优势在于延长模型稳定性。因此,CRD联合其他刺激因素主要用于模拟肝郁脾虚证和脾肾阳虚证。但目前尚无CRD模型的中医证型客观评价指标,各证型也缺乏统一的造模标准。同时,根据大便性状IBS可分为四个亚型包括腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)以及不确定型(IBS-U)。临床诊治IBS患者时,确定患者所患亚型为治疗的前提与疗效的保证。本团队前期研究发现,单一使用CRD造模难以确定模型的IBS亚型,同一批经CRD方法造模的大鼠可出现各种亚型,因此在研究IBS具体某一亚型时,不宜单一使用CRD造模,可联合其他刺激因素。

6 小结

动物实验是科研先导,建立成功的动物模型是实验成功的关键环节。综上所述,根据实验对象的选择,可将结直肠扩张法分为乳鼠CRD和成年大鼠CRD联合其他刺激因素两大类。随着IBS相关研究的进一步发展,研究者们根据不同的实验目的,可以选择合适的造模方法。目前中医证型的IBS模型制备方法尚不成熟,缺乏客观的IBS中医证型的评价标准,使用CRD动物模型研究IBS中医证型的模型评价指标等方面对于中医研究IBS具有重要科学意义。