茯神化学成分的研究

王军民， 刘思远， 杨 莹， 王 涛， 张红霞

(1.西南林业大学，西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2.中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术重点实验室，云南省野生资源植物研发重点实验室，云南 昆明 650223)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，是我国传统常用中药材[1],自生在松树森林植物群落中，靠吸收松树根部营养而生长发育[2]。茯神为茯苓块中穿有坚实细松根者，长宽4～5 cm，厚4～6 mm，松根直径不超过1.5 cm，边缘苓块可不成方形；茯苓中间生长的松木如为弯曲的松根，似朽木状，质松体轻，每根直径不超过2.5 cm，周围带有三分之二的茯苓肉则称之为茯神木[3]。茯苓和茯神具有较好的生物活性[4]，前者味甘淡，性平，具有利水渗湿、健脾等功效；后者载于《名医别录》，味甘淡，性平，功能宁心、安神、利水，治心虚惊悸、健忘、失眠、惊痫、小便不利。为探究茯神宁心、安神活性的物质基础，进一步开发和利用传统药用资源，本实验对其化学成分进行研究，从中分离鉴定出12个化合物，其中化合物1～2为木质素类，3～12为三萜类，1～8为首次从茯苓和茯神中分离得到。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司); Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×9.4 mm, 5 μm，美国Agilent公司);电喷雾电离质谱(ESI-MS) Bruker HTC/Esquire spectrometer 液相-离子阱色谱联用仪测定、Bruker AM-400 MHz 超导核磁共振仪测定(德国Bruker公司)。柱色谱硅胶G(100～200、200～300目)、薄层色谱硅胶G板(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20凝胶 (瑞典Amersham Pharmacia公司)。常用分离试剂工业级氯仿、乙酸乙酯、甲醇等重蒸后使用。

样品采自云南省临沧市双江拉祜族佤族布朗族傣族自治县茯苓种植基地，经西南林业大学胡勇副教授鉴定为茯神，标本(T20191012-2) 保存于西南林业大学标本馆，切片后去除外部茯苓菌丝，保留内部松根而得到茯神松根(下文通称茯神)，上述材料粉碎后过20目筛备用，茯苓母种为中国科学院5.78原种，栽培树桩为思茅松砍伐半年后树桩。标本保存在西南林业大学林学院植物资源利用系药用植物教研室。

2 提取与分离

取干燥茯神约2.2 kg，粉碎至20目，用75%乙醇加热回流提取3次，每次25 L，分别提取3、2、2 h后过滤，合并滤液并减压浓缩得到浸膏约420 g，加入适量水超声悬浮后得混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后得不同部分萃取物。取乙酸乙酯部分 (98 g)进行硅胶 (100～200目)柱层析，用石油醚-丙酮 (50∶1～ 0∶1) 梯度洗脱，合并后得到7个部分Fr.1～ Fr.7。Fr.1 (5.1 g) 经硅胶 (200～300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯 (30∶1～ 0∶1) 洗脱，薄层色谱展开检测后合并得到6个组分Fr.1.1～ Fr.1.6。组分Fr.1.3经过硅胶(200～ 300目)柱层析，石油醚-丙酮 (30∶1～ 1∶1)以及Sephadex LH-20凝胶氯仿-甲醇(6∶4)反复洗脱，得化合物11(42.6 mg)、12(61.8 mg)；组分Fr.1.5经过反复硅胶 (200～ 300目)柱层析，石油醚-丙酮 (15∶1～ 3∶1)柱层析，得化合物9(42.1 mg)、10(24.9 mg)。Fr.3 (12.3 g) 经硅胶 (200～ 300目)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯 (25∶1～ 0∶1) 洗脱，薄层色谱展开检测后合并得到8个组分Fr.3.1～ Fr.3.8。组分Fr.3.2经结晶和重结晶得化合物8(136.5 mg)；Fr.3.3经过反复硅胶(200～ 300目)柱层析，石油醚-丙酮(25∶1～ 3∶1)、氯仿-甲醇(50∶1～5∶1)以及Sephadex LH-20凝胶氯仿-甲醇(6∶4)洗脱纯化，最终得化合物3(15.1 mg)。组分Fr.3.4经过反复硅胶 (200～ 300目)柱层析，石油醚-丙酮 (20∶1～ 3∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～ 5∶1) 和半制备型HPLC分离，以乙腈-水(70∶30、60∶40)洗脱得化合物4(4.2 mg)、5(9.2 mg)、6(5.2 mg)；Fr.3.5经过反复硅胶(200～ 300目)柱，石油醚-丙酮 (20∶1～1∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～4∶1) 和半制备型HPLC分离，乙腈-水(60∶40)洗脱得化合物7(4.2 mg)；Fr.4 (16.5 g) 经过反复硅胶 (200～ 300目)柱，石油醚-丙酮(20∶1～1∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～ 2∶1) 以及Sephadex LH-20凝胶纯化氯仿-甲醇(1∶1)，最后采用半制备型HPLC分离，以乙腈-水(60∶40)洗脱得化合物1(6.5 mg)、2(3.2 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:褐色油状物 (CHCl3), 分子式C20H22O7，ESI-MSm/z: 374.1[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.89 (1H, s, H-2), 6.87 (1H, s, H-2′), 6.85 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.76～6.82 (3H, m, H-5′, 6, 6′), 4.72 (1H, d,J=5.0 Hz, H-7′), 4.71 (1H, s, H-7), 4.43 (1H, dd,J=8.6,7.5 Hz, H-9′), 4.02 (1H, d,J=9.0 Hz, H-9), 3.85 (3H, s,3-OCH3), 3.83 (3H, s, 3′-OCH3)，3.05 (1H, m, H-8′);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 127.1 (C-1), 133.2 (C-1′), 109.6 (C-2), 109.2 (C-2′), 146.8 (C-3), 146.1 (C-3′), 146.0 (C-4), 158.2 (C-4′), 114.8 (C-5), 114.2 (C-5′), 119.8(C-6、6′), 88.2 (C-7), 86.1 (C-7′), 92.1 (C-8), 60.0 (C-8′), 75.0 (C-9), 71.5 (C-9′), 56.0 (3-OCH3, 3′-OCH3)，以上数据与文献[5]报道基本一致，故鉴定为8-羟基松脂醇。

化合物2：棕色油状物(CHCl3), 分子式C20H22O6，ESI-MSm/z: 358.1[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.94 (2H, d,J=1.6 Hz, H-2, 2′), 6.90 (2H, d,J=8.2 Hz, H-5, 5′), 6.84 (2H, dd,J=8.2, 1.6 Hz, H-6, 6′), 4.78 (2H, d,J=4.3 Hz,H-7, 7′), 4.28 (2H, dd,J=7.0, 9.0 Hz,H-9, 9′), 3.94 (6H, s, 3, 3′-OCH3), 3.12 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 133.6 (C-1, 1′), 109.3 (C-2, 2′), 147.3 (C-3,3′), 145.7 (C-4, 4′), 115.1 (C-5, 5′), 119.6 (C-6, 6′), 86.4 (C-7, 7′), 55.9 (C-8, 8′), 72.3(C-9, 9′)。以上数据与文献[6]报道基本一致，故鉴定为松脂醇。

化合物3:白色粉末(CHCl3), 分子式C30H50O2，ESI-MSm/z: 442.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.72(1H, brs, H-29a), 4.61 (1H, brs, H-29b), 3.55 (2H, d,J=10.7 Hz,H-28), 3.16 (1H, t,J=7.3 Hz, H-3), 2.39 (1H, d,J=10.7 Hz, H-19), 1.40 (2H, t, H-11), 0.94～1.34 (各3H, m, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 40.9 (C-1), 27.6 (C-2), 79.3 (C-3), 39.8 (C-4), 55.8 (C-5), 69.3 (C-6), 42.5 (C-7), 40.6 (C-8), 51.4 (C-9), 36.9 (C-10), 21.5 (C-11), 25.8 (C-12), 36.8 (C-13), 43.3 (C-14), 27.7 (C-15), 33.7 (C-16), 47.9 (C-17), 48.9 (C-18), 47.7 (C-19), 150.5 (C-20), 29.9 (C-21), 29.9 (C-22), 27.9 (C-23), 17.9 (C-24), 18.2 (C-25), 17.3 (C-26), 15.8(C-27), 60.7 (C-28), 109.9 (C-29), 19.7(C-30)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定为白桦脂醇。

化合物4: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H48O3，ESI-MSm/z: 456.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.96 (1H, d,J=3.2 Hz, Ha-29), 4.78 (1H, s, Hb-29), 3.47 (1H, t,J=8.2 Hz, H-3), 0.83～1.82 (各3H, s, -CH3×6, H-23, 24, 25, 26, 27, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.4 (C-1), 28.4 (C-2), 78.2 (C-3), 39.6 (C-4), 56.1(C-5), 18.8 (C-6), 34.9 (C-7), 41.2 (C-8), 51.1 (C-9), 37.7 (C-10), 21.3 (C-11), 26.2 (C-12), 38.7 (C-13), 42.9 (C-14), 30.7 (C-15), 33.2 (C-16), 56.7 (C-17), 49.8 (C-18), 47.8 (C-19), 151.5 (C-20), 31.4 (C-21), 37.8 (C-22), 28.8 (C-23), 16.5 (C-24), 16.8 (C-25), 16.6 (C-26), 14.9 (C-27), 178.8 (C-28), 110.1 (C-29), 19.4 (C-30)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定为白桦脂酸。

化合物5: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H46O3，ESI-MSm/z: 454.3[H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.26 (1H, brs, H-12), 2.86 (1H, dd,J=4.0,13.5 Hz, H-18), 0.75～1.18 (各3H, s, -CH3×7, H-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.5 (C-1), 34.3 (C-2), 217.9 (C-3), 47.4 (C-4), 55.5 (C-5), 19.6 (C-6), 32.3 (C-7), 39.3 (C-8), 47.0 (C-9), 37.0 (C-10), 23.0 (C-11), 122.4 (C-12), 143.8 (C-13), 42.0 (C-14), 27.9 (C-15), 23.6 (C-16), 46.7 (C-17), 41.3 (C-18), 46.0 (C-19), 30.7 (C-20), 34.0 (C-21), 32.4 (C-22), 26.5 (C-23), 21.5 (C-24), 15.0 (C-25), 16.9 (C-26), 25.9 (C-27), 182.9 (C-28), 33.2 (C-29), 23.5 (C-30)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定为3-羰基齐墩果酸。

化合物6: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H46O4，ESI-MSm/z: 470.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.47 (1H, dd,J=3.2, 10.4 Hz, H-11), 5.61(1H, dd,J=1.8, 10.4 Hz, H-12), 3.67 (1H, t, H-2), 2.92 (1H, d,J=9.5 Hz, H-3), 0.78～1.03 (各3H, s, -CH3×6, H-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 47.7 (C-1), 69.5 (C-2), 84.5 (C-3), 38.9 (C-4), 56.3 (C-5), 19.5 (C-6), 34.2 (C-7), 40.5 (C-8), 55.7 (C-9), 37.2 (C-10), 127.0 (C-11), 126.3 (C-12), 136.6 (C-13), 41.8 (C-14), 26.3 (C-15), 41.5 (C-16), 51.4 (C-17), 135.6 (C-18), 38.3 (C-19), 43.3 (C-20), 33.6 (C-21), 30.7 (C-22), 28.9 (C-23), 17.4 (C-24), 19.6 (C-25), 16.9 (C-26), 24.6 (C-27), 178.9 (C-28), 23.8 (C-29), 32.8 (C-30)。以上数据与文献[9]报道基本一致, 故鉴定为脱氢山楂酸。

化合物7：白色粉末(CH3OH); 分子式C32H48O6，ESI-MSm/z: 528.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.52 (1H,m, H-23), 3.85 (1H, m, H-11), 2.83 (1H, d,J=8.4 Hz, H-24), 1.22 (3H, d,J=7.0 Hz, H-21), 0.92-1.43 (各3H, s, -CH3×7, H-18, 19, 26, 27, 28, 29, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 31.5 (C-1), 33.9 (C-2), 218.9 (C-3), 47.4 (C-4), 48.7 (C-5), 20.5 (C-6), 35.1 (C-7), 40.4 (C-8), 49.4 (C-9), 37.5 (C-10), 70.1 (C-11), 36.2 (C-12), 176.5 (C-13), 49.8 (C-14), 46.1 (C-15), 207.5 (C-16), 138.5 (C-17), 23.5 (C-18), 25.9 (C-19), 27.0 (C-20), 20.5 (C-21), 35.7 (C-22), 72.3 (C-23), 65.1 (C-24), 58.9 (C-25), 20.2 (C-26), 24.8 (C-27), 29.9 (C-28), 19.7 (C-29), 23.4 (C-30), 169.8、21.7 (-COCH3)。以上数据与文献[10]报道基本一致, 故鉴定为泽泻醇C-23-醋酸酯。

化合物8：白色针晶(CH3OH); 分子式C30H48O5，ESI-MSm/z: 488.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.12 (1H, s, H-12), 3.72 (1H, m,H-2), 2.68 (1H, dd,J=10, 4.2 Hz, H-3), 2.32 (1H, s, H-18), 0.84 (3H, d,J=4.2 Hz, H-30), 0.78 (3H, d,J=6.4 Hz, H-29), 0.64～1.26 (各3H, s, -CH3×7, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 46.9 (C-1), 67.3 (C-2), 82.6 (C-3), 39.2 (C-4), 55.0 (C-5), 18.4 (C-6), 32.9 (C-7), 40.6 (C-8), 47.2 (C-9), 38.0 (C-10), 23.6 (C-11), 126.9 (C-12), 138.8 (C-13), 41.7 (C-14), 28.3 (C-15), 25.4 (C-16), 47.2 (C-17), 53.4 (C-18), 71.9 (C-19), 41.4 (C-20), 26.2 (C-21), 37.5 (C-22), 29.3 (C-23), 16.5 (C-24), 16.8 (C-25), 17.4 (C-26), 24.2 (C-27), 177.9 (C-28), 26.8 (C-29), 16.2(C-30)。以上数据与文献[11]报道基本一致。故鉴定为2α,19α-二羟基熊果酸。

化合物9：白色粉末(CHCl3); 分子式C30H50O2，ESI-MSm/z: 454.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.28 (1H, t,J=3.2 Hz，H-12), 0.88 (3H, d,J=6.9 Hz, H-30), 0.98 (3H, d,J=6.9 Hz, H-29), 0.91～1.14 (各3H, s, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.7 (C-1), 34.3 (C-2), 217.8 (C-3), 47.6 (C-4), 55.3 (C-5), 19.8 (C-6), 32.9 (C-7), 39.6 (C-8), 46.9 (C-9), 36.9 (C-10), 23.6 (C-11), 125.8 (C-12), 138.3 (C-13), 42.6 (C-14), 28.2 (C-15), 24.3 (C-16), 48.2 (C-17), 52.9 (C-18), 39.4 (C-19), 38.9 (C-20), 30.9 (C-21),36.8 (C-22), 26.6 (C-23), 21.7 (C-24), 15.7 (C-25),17.2 (C-26), 23.6 (C-27), 181.9 (C-28), 17.2(C-29), 21.3 (C-30)。与文献[12]报道的化合物数据一致, 故鉴定为乌索酸。

化合物10：白色粉末(CHCl3); 分子式C30H48O3，ESI-MSm/z: 456.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 12.08 (1H, s, -COOH), 5.21 (1H, t,J=3.2 Hz，H-12), 4.77 (1H,d,J=4.7 Hz, 3-OH), 3.34 (1H, m, H-3), 0.83 (3H, d,J=7.0 Hz, H-30), 0.94 (3H, d,J=7.0 Hz, H-29)，0.60～1.12 (各3H, s, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 38.3 (C-1), 27.0 (C-2), 78.8 (C-3), 39.0 (C-4), 55.7 (C-5), 18.0 (C-6), 32.7 (C-7), 40.6 (C-8),47.7 (C-9), 36.3 (C-10), 22.9 (C-11), 124.5 (C-12), 138.8 (C-13), 42.6 (C-14), 27.5 (C-15), 23.8 (C-16), 47.9 (C-17), 52.8 (C-18), 38.9 (C-19), 38.4 (C-20), 30.2 (C-21), 36.5 (C-22), 28.3 (C-23), 15.3 (C-24), 16.1 (C-25), 17.1 (C-26), 23.3 (C-27), 181.3 (C-28), 16.9 (C-29), 21.1 (C-30)。以上数据与文献[13]报道基本一致,故鉴定为熊果酸。

化合物11：白色粉末(CHCl3); 分子式C31H50O4，ESI-MSm/z: 486.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.96 (1H, s, Ha-31), 4.82 (1H, s, Hb-31), 3.61 (1H, dd,J=6.0, 8.0 Hz, H-16), 3.43 (1H, dd,J=7.5, 8.5 Hz, H-3), 2.95 (1H, m, H-20), 0.95 (3H, d,J=7.0 Hz, CH3-26), 0.97(3H, d,J=7.0 Hz, CH3-27),1.02～1.43 (各3H, s, -CH3×5, H-18, 19, 28, 29, 30);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 36.0 (C-1), 28.9(C-2), 78.4 (C-3), 39.8 (C-4), 51.3 (C-5), 18.9 (C-6), 27.4 (C-7), 135.1 (C-8),135.4 (C-9), 37.7 (C-10), 21.0 (C-11), 29.7 (C-12), 46.7 (C-13),49.3 (C-14), 43.9 (C-15), 76.9 (C-16), 57.5 (C-17), 17.9 (C-18), 19.4 (C-19), 48.9(C-20), 178.9 (C-21), 31.7 (C-22), 33.6 (C-23), 156.2 (C-24), 34.4 (C-25), 22.1 (C-26), 21.8 (C-27), 28.8 (C-28), 16.5 (C-29), 25.7 (C-30), 107.3 (C-31)。以上数据与文献[14]报道基本一致, 故鉴定为土莫酸。

化合物12:白色粉末(CHCl3); 分子式C33H52O5，ESI-MSm/z: 528.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.81 (1H, s, Ha-31), 4.79(1H, s, Hb-31), 4.45 (1H, dd,J=7.5, 8.5 Hz, H-3), 3.98 (1H, dd,J=6.0, 8.0 Hz, H-16), 2.33 (1H, m, H-20), 2.06 (3H, s, -COCH3), 0.98 (3H, d,J=6.4 Hz, H-27), 0.97 (3H, d,J=6.4 Hz, H-26), 0.76～1.13 (各3H, s, -CH3×5, H-18, 19, 28, 29, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 35.5 (C-1), 24.8 (C-2), 80.6 (C-3), 38.3 (C-4), 51.7 (C-5), 18.7 (C-6), 26.9 (C-7), 135.6 (C-8), 135.9 (C-9), 37.4 (C-10), 21.2 (C-11), 29.9 (C-12), 46.8 (C-13),48.8 (C-14), 43.9 (C-15), 77.4 (C-16), 58.2 (C-17), 18.1 (C-18), 19.4 (C-19), 48.7 (C-20), 179.2 (C-21), 32.0 (C-22), 33.5 (C-23), 156.3 (C-24), 34.3(C-25), 22.4 (C-26), 22.1 (C-27), 28.2 (C-28), 17.1 (C-29), 25.9 (C-30), 107.6 (C-31), 21.5 (-COCH3), 170.6 (-COCH3)。以上数据与文献[15]报道基本一致, 故鉴定为茯苓酸。

4 讨论

本研究从茯神所抱松根中分离得到12个化合物，木质素类2个和三萜类8个。木质素化合物1～2可能直接来源于松树本身[16]，化合物3～12均为三萜类，其中9～12可能来源于在松根内生长和残留茯苓菌丝[15, 17]，化合物3～8具体来源有待进一步研究。茯苓主要含有的化学成分是多糖类、三萜类、甾醇类等, 在茯神所抱松根内三萜的含量远高于白茯苓的三萜，三萜类成分可能为茯神功效区别于茯苓的重要物质基础，茯神三萜类物质类型和功效有待于进一步开发。