循环肿瘤细胞簇促进血行转移的分子机制研究

刘 洋，郑 茜，郑秀芹，范 辉，陆 茵，王爱云，陈文星

(南京中医药大学药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指从实体恶性肿瘤原发灶或者转移灶释放进入外周血液循环的肿瘤细胞，是导致肿瘤转移及复发的重要因素。肿瘤患者外周血中还存在团簇形式的CTC，称之为循环肿瘤细胞簇(circulating tumor cells clusters，CTC clusters)。Watanabe等最早在癌症患者的外周血中证实 CTC clusters 的存在，它是由两个或者两个以上的CTC聚集形成。研究发现，CTC clusters 比单个CTC具有更强的转移能力，其转移能力比单个CTC高出23-50倍[1]。肿瘤的血行转移是指肿瘤细胞在侵入血管后随血液在循环中运行并附着在远端血管内皮的过程，在整个肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的血行转移至关重要，有的肿瘤细胞在肿瘤切除手术之前就发生了血行转移则很大概率导致肿瘤的复发。因此，探究循环肿瘤细胞簇的形成机制，限制其血行转移能力或许可以减少肿瘤的复发，并为临床治疗肿瘤转移提供新的依据。

1 CTC clusters的特征起源

肿瘤细胞在血液循环中的存在形式既有单个肿瘤细胞形式——即循环肿瘤细胞，也有团簇形式——即循环肿瘤细胞簇，而不同的细胞形式所具有的转移特性及能力也大不相同，CTC clusters属于单克隆细胞群，以团簇的形式从癌症病灶脱落进入血液循环[2]。

1.1 CTC clusters的结构特性与单个CTC相比，CTC clusters在循环中运行体积大、速度慢，容易在内脏微血管滞留，CTC clusters的这些物理特性提高了肿瘤细胞在远处器官发生定植的几率[3]，被拦截下来的肿瘤细胞与血管内皮细胞相互作用形成肿瘤细胞的外渗。从物理生物学的角度研究，CTC clusters倾向于通过与E-钙黏素相互作用发生边缘化、旋转和内皮的黏附[4]。CTC团簇的移动速度远低于单个CTC，即使在直径不足以拦截团簇的血管中，也易于边缘化和附着在血管壁上。此外，这种簇状结构还为其中的肿瘤细胞提供了特殊的微环境，并且该微环境根据簇的大小和组成而变化，细胞簇越大、连接越紧密，给肿瘤细胞提供的微环境更加低氧[5]，利于肿瘤细胞的生存。

近年来，研究人员发现CTC clusters还存在可变形性，Au等[6]使用微流体装置和斑马鱼模型，发现包含≤20个细胞的CTC团簇能够通过重组成单链状几何结构而通过毛细血管，且这些CTC团簇的形状是高度可塑性的，在穿过毛细血管后，细胞能够轻松地再次重组为球形簇，这一发现进一步加深了我们对基于CTC clusters的转移的理解。

1.2 CTC clusters形成的分子机制血行转移中CTC clusters的显著特征是其表层具有血小板包被，但关于调控血小板黏附聚集形成细胞簇的分子机制却少有报道，下面就几种参与CTC clusters形成的关键蛋白进行阐述。

1.2.1Podoplanin诱导血小板黏附聚集促进CTC clusters形成 Podoplanin(PDPN)名为血小板聚集诱导因子Aggrus，也称平足蛋白，是一种在多种肿瘤细胞表面表达的I型跨膜粘蛋白样糖蛋白，它可以通过与血小板相互作用并激活血小板受体C型凝集素样受体-2(C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2)，促进肿瘤细胞与血小板相互聚集形成CTC clusters，从而促进肿瘤细胞血行转移，有研究证明，抑制PDPN和CLEC-2受体的相互作用可以抑制CTC clusters的形成[7]。这些结果表明，PDPN可能通过促进血小板激活、血小板-肿瘤细胞相互作用继而促进CTC clusters的形成，促进肿瘤细胞血行转移。

1.2.2Fibronectin促进血小板与肿瘤细胞黏附和CTC Clusters形成 纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种二聚体糖蛋白，广泛参与细胞迁移、黏附以及止血等生理病理过程。血浆的FN在血液中循环，并且在组织损伤时，掺入纤维蛋白凝块中以对血小板功能发挥作用并介导止血过程。FN在多种肿瘤中异常表达，对肿瘤细胞的转移和血管生成等有促进作用[8]。FN是多种整合素受体的配体，在介导细胞黏附时，FN上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列可识别细胞表面整合素异二聚体并与之结合，进而影响细胞黏附、迁移等；在介导凝血过程中，FN与血小板整合素受体形成强力结合，促进血小板的黏附聚集及其促凝血活性[9]。FN还可通过与肿瘤细胞表面整合素αvβ3、αvβ6等相结合组装于肿瘤细胞表面，与血小板表面整合素αIIbβ3结合促进血小板向肿瘤细胞黏附聚集，促进CTC clusters的形成[10]。

1.2.3Plakoglobin介导血小板黏附聚集促进CTC clusters形成 Plakoglobin(PG)也叫盘状珠蛋白，与β-catenin同源，是黏着连接和细胞桥粒组成成分，介导细胞间的黏附作用。研究表明，敲除CTC clusters 中的PG或下调其表达可显著减少CTC clusters 的形成和转移，且以PG为肿瘤转移靶标的抗肿瘤转移治疗策略在实际抗肿瘤转移的药物筛选中已经有所应用[11]。另一方面，PG参与并调节血小板内皮细胞黏附分子(CD31)的形成。敲低PG的表达，能够显著抑制CD31的活性，并使得E-cadherin的膜分布不稳定、integrin-β3活性下降，最终导致细胞黏附性降低、血小板聚集减少。PG还可以维持FN mRNA的稳定性，增加肿瘤细胞内源性FN的表达，而PG的缺失可显著降低FN的表达、CTC Clusters的形成和远端转移[12]。

2 CTCs聚簇增强血行转移能力的分子机制

肿瘤转移实际上是个低效过程，相比大量进入血液循环的肿瘤细胞，能够在远端成功定植的少之又少。究其原因是CTCs失去原位肿瘤基质的依托，在血行转移中面临巨大的生存压力，主要包括氧化应激、血流剪切力和免疫追杀等[13]，探究循环肿瘤细胞簇血行转移能力增强的原因，对于临床针对肿瘤转移治疗具有指导性作用。

2.1 细胞间黏附蛋白细胞间的黏附蛋白是CTCs在血液循环中以单个还是成簇类型存在的决定因素。相关报道显示，黏附蛋白的高表达使得肿瘤细胞聚集成簇，增加其转移潜力，大大缩短患者的生存期。例如，Plakoglobin在细胞间黏附结构中起到将E-钙黏素和α-连环蛋白连接的作用，维持了循环肿瘤细胞簇状结构稳定和细胞极性。除此之外，Plakoglobin还参与多种致癌信号通路，Kolligs等通过在大鼠RK3E上皮细胞中过表达Plakoglobin，促进了肿瘤转移，潜在的分子机制是该蛋白的过表达导致c-Myc的上调和TCF/Lef信号的激活；Chen等[14]研究表明，敲除桥粒芯蛋白3(DSG3)会破环其与Plakoglobin的结合，并导致c-myc、cyclin D1和MMP-7下游靶基因的表达下调，从而抑制细胞迁移和侵袭。Fibronectin的合成受血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)以及转化生长因子β1蛋白(TGF-β1)的调节，PDGF能够诱导TGF-β1的分泌，从而促进FN的合成与沉积，在CTC Clusters中，血小板的黏附聚集促使其分泌PDGF和TGFβ-1，使得FN合成增多，进一步加强了CTC Clusters的稳定性，增加了其在血行转移中的生存能力[12]。Takagi等[15]培育出了Podoplanin的人单克隆抗体——MS-1，并且发现它能够抑制PDPN-CLEC-2结合、PDPN诱导的血小板聚集以及PDPN介导的肿瘤转移。

总的来说，参与CTCclusters形成的蛋白涉及多条通路，在肿瘤的发生发展中起着重要作用，因此可能作为潜在的预后生物标志，成为治疗肿瘤转移的靶标。

2.2 肿瘤细胞的EMT过程上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种对胚胎形成、伤口愈合和肿瘤恶性进展至关重要的细胞程序，EMT导致细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用被重塑，使得肿瘤细胞由迁移能力弱的上皮状态向侵袭能力强的间质状态转化。同时，EMT增加了肿瘤细胞的转移潜能，是肿瘤细胞产生耐药性的重要原因[16]。

EMT相关的转录因子可以将非转移性癌细胞转变成能够侵袭和转移的细胞，有研究表明，胰腺癌小鼠模型中ZEB1和SNAIL的表达是癌细胞侵袭和转移所必须的[17]，SLUG的表达可以使得原本非转移细胞获得转移能力[18]，证实了EMT过程对于肿瘤转移的重要性。而在成簇脱落的循环肿瘤细胞中经历的是部分EMT，经过转化后，外部以间质状态存在，而内部仍保持上皮连接状态，外周的间质细胞为内部上皮细胞的转移铺平了道路[19]。多项研究表明，上皮连接成分的持续表达对于CTC clusters本身的稳定性是必需的，而间质细胞则进一步增强了转移潜能[20]。此外，来自同一肿瘤患者的CTC clusters中上皮/间质表达并不是恒定的，而是随着耐药性的产生，间质细胞的比例也随之上升，当引入新的有效治疗方案，间质细胞比例又急剧下降[21]。上述研究表明，CTC clusters中EMT特征不仅反映了其固有的侵袭性，还能反映治疗方案的耐药情况，但关于EMT在循环肿瘤细胞簇的转移过程的具体状态尚未得到完全阐明，探究影响上皮/间充质状态的信号通路是开发靶向治疗处于不同状态肿瘤细胞的关键步骤。

2.3 DNA甲基化DNA甲基化异常，包括全基因组低甲基化和高甲基化，与多种人类癌症相关，两种表观遗传修饰均具有改变邻近基因表达并促进癌症发展的能力[22]。Gkountela等[1]通过分析来自乳腺癌患者和NSG小鼠异种移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)中CTCs的DNA甲基化图谱，发现了诸多甲基化差异区域(differentially methylated regions，DMRs)，单个CTC中低甲基化转录因子结合位点(Transcription factor binding sites，TFBS)包括JUN，MIXL1、SHOX2、MEF2C等，这些基因常在各种肿瘤中富集；而CTC聚簇导致主导干性和调节增殖相关基因的TFBS特异性低甲基化，例如OCT4、MANOG、SOX2和SIN3A，并伴随有多梳抑制复合物2(polycomb-repressive complex 2，PRC2)目标基因启动子和基因体(包括SUZ12和EED的靶标)超甲基化及H3K27me3抑制，这些改变共同增加了CTC clusters的血行转移能力。循环中CTCs表型的差异决定了DNA甲基化状态，因此监测异常的DNA甲基化可能是一种富有前景的提前发现肿瘤恶化的手段，可用于肿瘤的早期检测、去甲基化治疗和预后评估。

2.4 异质性来自同一个体血液循环中的CTC clusters并非简单的由肿瘤细胞聚集而成，而是由肿瘤细胞、血小板、成纤维细胞和相关黏附蛋白等共同组成的，这些非肿瘤细胞成分有利于CTCs的生存和转移。血小板通过旁分泌信号传导和直接接触来物理屏蔽其他复杂的影响，从而保护肿瘤细胞免受血液剪切损伤和免疫攻击[23]。血小板还可以通过分泌TGF-β并与肿瘤细胞直接相互作用，通过TGF-β/Smad和NF-κB途径诱导肿瘤细胞进行EMT。成纤维细胞的存在增加了CTC clusters内肿瘤细胞的活力，并促进了转移的形成，而当癌症相关的成纤维细胞部分耗尽时，可以观察到转移的数量明显减少[24]。总而言之，CTC clusters复杂的组成具有明显的异质性，未来的研究应着重于CTC clusters组成的动态变化，关注个各成分之间的相互作用及对转移的影响。

3 CTC clusters在肿瘤转移中的作用

肿瘤转移是个复杂的、多步骤的过程，现代研究将肿瘤转移过程大致分为以下环节，即：肿瘤细胞脱离原发部位、肿瘤血管生长、肿瘤细胞渗透进入血管、肿瘤细胞在血液循环中运行、肿瘤细胞溢出血管、肿瘤细胞在目的器官植入并生长。在整个肿瘤转移过程中，CTC clusters在其中扮演了一个转移前体“种子”的角色，通过血行转移到达合适的“土壤”器官进行定植，最终形成转移病灶。CTC clusters的分子特征体现了其生存优势和转移潜力，同时为肿瘤治疗过程中产生耐药性的机制提供了新的线索。当前对CTC clusters的研究集中在影响CTC clusters内肿瘤细胞聚集的分子，这些分子可能成为治疗的良好靶标。在乳腺癌的研究中已经发现，盘状珠蛋白和角蛋白-14与桥粒和半桥粒密切相关，对CTC clusters的形成至关重要[11,25]，抑制这些蛋白的表达可减少CTC clusters的形成和肿瘤的转移。此外，一些促炎细胞因子，例如白介素-6和肿瘤坏死因子-α也可以促进肿瘤细胞成簇生长，并在循环系统中诱导黏附募集[26]。

现有的研究部分阐明了CTC clusters具有更高转移潜能的原因，主要涉及黏附聚集、甲基化、EMT、异质性等。此外，还有报道表明，CTCclusters通过循环的galectin-3和癌症相关的粘蛋白1(MUC1)之间的相互作用减少凋亡，同时促进了CTC clusters在循环系统中的形成和存活[27]。通过与肿瘤细胞表面的MUC1相互作用，循环中升高的galectin-3也促进了肿瘤与内皮细胞间的黏附。这些发现进一步加深了我们对CTC clusters转移机制的认识，并提供了一种预防转移的新颖治疗方法。

4 CTC clusters的临床治疗价值

CTC clusters在肿瘤患者的早期检查、治疗效果评估和肿瘤复发检测等方面具有巨大的潜力，且已经参与了许多临床前研究和临床试验。研究人员对CTC clusters临床意义的探究，发现患者循环中存在的CTCs与不良生存结局密切相关。

针对细胞簇的治疗手段也逐年兴起。Aceto等[2]通过筛选2 486种FDA批准的化合物，发现Na+/K+-ATP酶抑制剂通过增加细胞内钙离子浓度，可以抑制肿瘤细胞间紧密连接和桥粒的形成，达到解离CTCclusters的效果，并在小鼠模型上证实了其对肿瘤转移能力的抑制作用。

人类和实验动物中的大多数实体瘤都包含大量的纤维蛋白，提示纤维蛋白和纤维蛋白原在肿瘤发生和转移中发挥重要作用。研究发现，低分子量的肝素可直接导致血纤维蛋白溶解，肝素治疗的患者具有明显的生存收益，但研究尚未证实肝素和其他抗血栓形成药物的抗肿瘤转移作用是否对临床有益。目前，溶栓剂(如尿激酶)破坏细胞聚集的能力已得到充分证明，该特性有时可用于癌症患者血管内凝血，Choi JW等将尿激酶静脉注射到肺癌模型小鼠，成功提高了小鼠的存活率，显示了针对CTC clusters的治疗潜力，解离循环中的CTC clusters可以很大程度减少癌症的转移[28]。因此，除了靶向黏附蛋白外，直接作用血纤蛋白原可能是控制CTC clusters的另一种有前景的方法。

治疗期间CTC clusters的基因表达和变化也引起了研究人员的注意，在前列腺癌患者中，抗氧化剂基因的表达水平具有良好的预后和预测价值，可用于评估治疗和监测肿瘤复发。血行转移中，Zhang等[29]发现编码COX-2的PTGS2基因上调程度较高,COX-2是诱导型酶，在乳腺癌，结直肠癌，肺癌和胰腺癌和黑素瘤中经常过表达，并且与不良预后相关，可将花生四烯酸转化为前列腺素，提高癌细胞存活率，增加生长、迁移、侵袭能力和干细胞样特性，并且与血管生成和免疫抑制相关，揭示了COX-2抑制剂在抗转移中的潜在应用。

CTC clusters的临床价值毋庸置疑，通过解离CTC clusters或许可以减少肿瘤的转移，但解离后形成的单个CTC对转移的影响仍然也需要注意，因此，关于CTC clusters合理的临床应用策略还需要进一步研究。

5 总结与展望

在肿瘤细胞的血行转移过程中，与单个CTC相比，CTC clusters赋予了肿瘤细胞更强的生存能力。通常脱离基质的肿瘤细胞首先面临失巢凋亡的威胁，而乳腺癌PDX模型中CTC clusters的RNAseq分析结果显示凋亡相关的信号通路整体下调，这与检测到抗凋亡蛋白Bcl-2过表达的结果相一致，共同增加了CTC clusters的抗凋亡能力。进入循环中CTC clusters主要面临血流剪切力以及免疫系统的杀伤，目前普遍认为CTC clusters中发生的部分EMT使其产生的可变形性是抵抗血流剪切力的主要原因，而免疫逃逸涉及多种机制，例如免疫检查点在CTC clusters中过表达、II型干扰素和TNF信号传导途径下调、T细胞激活基因的下调等[13]。总的来说，CTCclusters对肿瘤血行转移更为重要，能够完整的显示CTCs携带的遗传信息，更适合作为液体活检的生物标志物来评价治疗效果、检测肿瘤复发以及用于预后评估。

但在CTC clusters的研究中仍有几个问题亟待解决，首先是CTC clusters的分离检测难题，目前的分离系统主要是针对单个CTC的分离筛选，而CTC clusters因其在循环中的稀有性导致了捕获难度大幅增加，形态上个体差异大，难以匹配合适的孔径，且容易造成滤孔堵塞，使得捕获后不易完整释放，进而影响下游分析，因此首要目标是确定一套合适的分选技术和评价标准[30]。其次，CTC clusters的形成机制尚未完全解释清楚，目前报道的PDPN、FN和PG等黏附蛋白在介导血小板结合肿瘤细胞形成CTC clusters中发挥了重要作用，通过探究CTC clusters的形成机制，可以更好的指导临床合理用药进行针对治疗。最后，CTC clusters内部的异质性始终是个复杂问题，关注CTC clusters组成的动态变化，探究各个成分之间的相互作用及对转移能力的影响也是未来研究的主要方向。