影响动物血凝和血凝抑制试验结果的因素分析

叶裕香

（宁德市动物疫病预防控制中心，福建 宁德 352100）

血凝和血凝抑制试验是进行动物疫病诊断和免疫抗体水平监测最常用的方法之一，常用于禽流感、鸡新城疫等动物疫病的血清学监测，在实际操作过程中，常因实验人员的操作水平，实验环境因素，血清采集质量等环节的影响，导致试验结果偏差。现将主要影响因素归纳如下，供参考。

1 试验前准备的影响

1.1 试剂的配制准备 稀释液最好是用0.01mol/LpH7.2的等渗磷酸盐缓冲液（PBS)，宜现配现用，如果用生理盐水代替PBS液，要使用新开瓶的灭菌生理盐水；阿氏液应经高压灭菌4℃保存备用。

1.2 试验用1%鸡红细胞悬液的配制 试验前应准备好3只以上的无特定免疫公鸡（SPF健康公鸡）或无禽流感、无新城疫抗体的健康公鸡，如果直接使用体内存在上述抗体的公鸡将会对试验结果产生影响。采血时，应无菌操作，按采血量的一定比例先抽取配好的阿氏液，然后采血，采血量与阿氏液等体积混合，反复颠倒几次，充分混均，防止血液凝固。采血后，将采出的3～4只公鸡血混合后再离心，这样配出的红细胞均匀一致。洗涤红细胞时切记吸放红细胞及注入PBS液时应尽量轻柔，切忌用力，否则红细胞会破裂造成溶血，影响试验结果。在洗涤红细胞过程中，每次离心后均应将白细胞层等吸除干净。如果所配制的红细胞浓度偏高，则血凝价可能偏低，血凝抑制价可能偏高；如果红细胞浓度偏低，则血凝价可能偏高，血凝抑制价可能偏低。

1.3 试验用反应板的及耗材的准备 试验用反应板有两种，分有机反应板和塑料反应板。一般使用96孔90度V型微量反应板，最好使用一次性96孔90度V型优质塑料反应板，可避免因有机反应板清洗不净和过度磨损影响试验结果和判定。

吸头应选择密封良好的环口，薄壁和嘴口尖的吸头，易于安装或卸脱，吸头表面光洁平滑，防止液体滞留外壁引起误差。吸头应与加样器上吸头套管密封完好，可防止由于空气泄露而造成加样精度或准确度的误差、尽可能使用一次性吸头。

2 试验中操作的影响

2.1 温度的影响 试验测定前，首先应保证在室温（20～25℃）环境下进行，也可将反应板放在恒温箱内控制试验温度。检测时避免处于通风口下或其附近，以免由于过冷或过热引起蒸发。

2.2 移液器正确使用的影响 移液器使用时要用力均匀，吸头要安装牢固，吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不允许突然松开，以免因吸液过快，产生气泡，影响加样。使用时应采用一档吸液二档排液的方法。移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬空垂直加样。

2.3 血凝结果的判定影响 血凝结果的判定，直接影响到4U抗原的配制。一定要准确把握最大凝集度，就是凝集不流淌。4U抗原配备也要求准确，如果配备的抗原效价高，抗体滴度就会低，反之抗体滴度会高，一般宜现用现配。可用回归试验来判定效价测定的正确与否。做法：做4排，每排的1～4孔加入PBS液50μL，取配好的4U抗原50μL与第一孔做倍比稀释至最后一孔并弃掉50μL，最后每孔加入50μL红细胞悬液，震荡，静置20min观察结果，如果第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，则说明4U抗原配制正确。

2.4 试验时间把握的影响 正常在室温（20～25℃）环境下，每孔加入4U抗原后，静置时间应至少30min，以完成抗原抗体反应；然后再加入已配好的1%的红细胞悬液，再静置时间40min。最后倾斜45度，观察结果。

3 结果判定的影响

试验结果判定的及时性会影响到准确性。检测中，每次试验均应设抗原与PBS对照，加入1%的红细胞悬液后，每隔5min应观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。

4 其它的影响因素

4.1 血清样品的保存 血清样品离心后，分装至1.5mL离心管中，标记清楚，对应编号冷藏送检。一般情况下，在5d内检测的样品可放置于4℃冰箱中冷藏，否则应低温冷冻保存。

4.2 非特异性因子的影响 检测水禽时，还常常会出现前几孔和最后几孔凝集而中间孔沉淀的现象，这是由于水禽血清中含有非特异性血凝抑制因子导致的。建议试验中用水禽的血配制1%的红细胞悬液来做水禽的抗体检测，这样可以大大地减少这种现象的发生。

4.3 倍比稀释的影响 倍比稀释时每孔至少反复吹吸5～6次，以便混合均匀，还应注意尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。

4.4 人为因素的影响 比如加样时漏加或重复加样等。因此，在试验中应做到安静并集中注意力，加好每个样。