T细胞耗竭与CAR-T细胞免疫疗法①

王红霞 徐广贤 （宁夏医科大学，银川750004）

CAR-T 细胞免疫疗法是以T 细胞为来源，进行体外基因修饰后回输治疗的一种过继性细胞疗法，其在识别肿瘤细胞时由于不受MHC限制，可有效避免肿瘤逃逸［1］。但长期肿瘤抗原及其他免疫抑制信号刺激导致CAR-T 细胞功能逐渐衰减，无法有效杀伤肿瘤细胞。因此，阐明Tex 形成的具体分子机制有利于寻找逆转CAR-T 细胞功能的最佳策略，此外，联合其他肿瘤免疫治疗方法有望进一步延伸CAR-T细胞疗法在肿瘤治疗中的应用。

1 T细胞耗竭

T 细胞耗竭（T cell exhaustion，Tex）最初用于描述慢性病毒感染时T细胞在持续抗原刺激下的一种功能异常状态，最近报道，参与肿瘤免疫的T细胞也存在相似现象［2-3］。T 细胞发生耗竭时，其生物学功能主要表现为：抑制性受体PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等表达持续增加或同时共表达多个抑制性受体；效应功能渐进性降低：包括细胞因子释放情况（IFN-γ、IL-2）与穿孔素、颗粒酶产生情况；增殖能力及自我更新能力（依赖于IL-7、IL-15）降低；代谢改变，耗竭性T 细胞线粒体活性降低，糖酵解受限，代谢储备能力降低。

研究表明，耗竭性T 细胞不同于效应性T 细胞（T effector，Teff）KLRG1+CD127−及记忆性 T 细胞（T memory，Tmem）KLRG1-CD127+等，而是具有独特分子表型的一群异质性细胞［4-5］。TCF-1+PD-1intTIM-3−为 Tex 祖细胞表型，TCF-1−PD-1hiTIM-3hi为终末 Tex表型，此外，CXCR5也可能作为祖细胞标志之一［6-7］。HUDSON 团 队［8］最 新 发 现 ，TCF-1−PD-1+TIM-3+CX3CR1+可能为耗竭性T 细胞中间态细胞群，这种中间态的CX3CR1+细胞发挥效应的程度近似Teff。阻断 PD-1 后 TCF-1−PD-1+TIM-3+CX3CR1+细胞群增加，暗示该中间态可能是PD-1营救后主要发挥抗肿瘤效应的细胞群体。目前，Tex 来源尚未统一，可能为初始 T 细胞（naïve T cell，Tn）接受活化信号后先分化为耗竭性T 细胞前体，前体细胞进一步分化为中间态，最终发育为TCF-1−PD-1hi末端状态［9］。

2 Tex分子机制

急性感染时，Tn 经抗原活化增殖发挥杀伤效应，约5%T 细胞转化为记忆性细胞，以非抗原依赖方式进行自我更新，当再次接触相同抗原时，立即进行免疫应答。但当感染持续存在时，T 细胞接受慢性持久刺激，活化与分化发生异常改变。导致T细胞处于耗竭状态的潜在分子机制主要为：①DNA甲基化或组蛋白乙酰化的改变，如编码抑制性受体PD-1，以及与记忆、效应分子等相关基因发生DNA甲基化或组蛋白乙酰化，从而影响基因表达［10-11］。GHONEIM 等［10］发 现 DNA 甲 基 化 酶 3a（De novo methyltransferase 3a，DNMT3a）介导的 DNA 从头甲基化促进耗竭性T 细胞前体形成，给予去甲基化药物decitabine 治疗后，CD8+T 细胞耗竭得到改善，联合PD-1 单抗治疗时，小鼠肿瘤负荷降低，转录因子表达改变。CHEN 等［4］采用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）Arm 与C113分别制备急性及慢性小鼠感染模型，采用单细胞测序技术结合模拟分化时间预测发现，T 细胞在发展为Tex 的早期阶段，TCF-1起决定性作用，其潜在机制可能是通过拮抗促进T细胞向Teff 分化的转录因子，而正向调节Emoes、CMyb 等与记忆及存活相关的转录因子，从而促进T细胞向Tex 方向发育。此外该研究发现，PD-1 表达有助于耗竭性T 细胞前体形成，保护其因过度活化而凋亡。除TCF-1 作为促进Tex 发展的转录因子外，2019年《Nature》3篇文章报道TOX同样促进Tex祖 细 胞 形 成［5，12-13］。 此 外 NR4A 家 族 、BLIMP-1、NFAT、Emoes、T-bet 等均参与耗竭 T 细胞生成［14-17］；②肿瘤微环境因素，包括调节性T 细胞（regulatory cells，Tregs）、骨髓来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、M2 型巨噬细胞等抑制性免疫细胞，IL-10、IL-6、TGF-β等抑制性细胞因子，以及肿瘤细胞周围纤维母细胞等均促进CD8+T细胞耗竭形成［18-20］；③小分子 RNA 参与，如 miRNA-155、miR-143、miR-146a 等通过多种方式调节T 细胞记忆、效应功能及代谢等相关基因表达［21-23］。

3 CAR-T细胞免疫疗法

CAR-T 细胞疗法是指通过体外对T 细胞进行基因修饰，赋予其靶向杀伤肿瘤细胞特性，经扩增培养后回输患者的一种细胞免疫疗法。目前该免疫疗法主要用于血液系统肿瘤治疗，靶点为CD19，此外，CD20、CD22 等多靶点联合治疗也显现出较好效果［24-26］。实体瘤治疗方面，由于肿瘤特异性抗原缺乏及肿瘤微环境等因素，其应用受阻。在研靶点包括 HER-2、GD2、Mesothelin、CEA、PSCA 等，主要针对乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌等，针对CAR-T 细胞在实体瘤治疗方面的应用，主要应对策略包括：①采用基因编辑技术（ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9）改造 CAR-T 细胞。HU 等［27］与 GUO 等［28］研究发现，敲除PD-1 后，CAR-T 细胞对肝癌细胞及Mesothelin阳性的三阴性乳腺癌细胞杀伤力明显增强。此外，EYQUEM 等［29］利用 CRISPR/Cas9 技术将 CAR 基因“精准”递送至 T 细胞受体（T-cell receptor α con⁃stant，TRAC）基因座，避免常规慢病毒载体或其他递送方式将CAR 基因随机插入T 细胞基因组而引发潜在细胞癌变，这种编辑方式制备的CAR-T 细胞在小鼠白血病模型中相比常规CAR-T 细胞显现出更强的杀伤力；②设计多靶标CAR。BIELAMOWICZ等［30］将HER2、IL13Rα2、EphA构建到同一CAR框中研究其对恶性胶质瘤的杀伤作用，结果表明其杀伤效应优于单独或双靶点；③联合其他免疫疗法。MA等［31］开发一种可使CAR-T 细胞在淋巴结提前进入激活状态的疫苗，结果显示，该联合治疗在胶质母细胞瘤、乳腺癌及黑色素瘤等多种小鼠肿瘤模型中均产生较好效果；④组成性表达IL-23、IL-7/CCL-19等细胞因子［32-33］；⑤胞内共刺激分子选择、制备通用CAR-T 细胞、优化CAR-T 细胞体外培养体系、制备TSCM、TCM 表型 CAR-T 细胞、改善 CAR-T 细胞耗竭等对CAR-T 细胞杀伤实体瘤均有一定促进作用［34-41］。

4 耗竭性CAR-T细胞

CHEN 等［16］和 SEO 等［17］发现，与 HBV/HCV 感染时出现的Tex 相似，肿瘤浸润性CAR-T 细胞相较于体外制备的CAR-T 细胞，可高表达NR4A、TOX 等T 细胞耗竭相关转录因子。当敲除或沉默TOX、TOX2，Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3 基因后，黑色素小鼠肿瘤负荷减小，生存时间延长，同时沉默TOX 与NR4A效果更为显著。进一步研究发现，NR4A、TOX 及NFAT 3 个转录因子可能在pdcd-1 启动子上游约23 kb共同形成转录增强子复合体，从而调节pdcd-1基因表达。WEI 等［42］从细胞代谢角度出发，靶向代谢相关因子REGNASE-1，CD8+T 细胞发生重编程，扩增能力、体内存留时间、效应功能等都得到提升，对小鼠白血病与黑色素瘤均显示较好疗效，可能通过影响BAFT、PTPN2 与SOCS1 等基因表达发挥作用 。 ZOU 等［43］采 用 CRISPR/cas9 技 术 同 时 敲 除PD-1、TIM-3、LAG3 免疫抑制性受体，表现出更佳肿瘤控制效果，具体分子机制可能为敲除抑制性受体后一方面阻断肿瘤细胞传导抑制信号，另一方面CAR-T 细胞表面 CD56 表达上调，促进 CAR-T 细胞存活，改善耗竭状态从而增强功能。

除肿瘤微环境因素导致CAR-T 细胞耗竭外，CAR-T细胞自身区别于天然T细胞，CAR 结构引入，尤其胞内共刺激分子不同，使制备的CAR-T 细胞因“噪声信号”引起非抗原依赖T 细胞过度活化，导致Tex发生。LONG等［34］观察到胞内刺激分子为4-1BB时，相比CD28 CAR-T 细胞存活时间更久；LYNN等［15］发现，相较于 CD19-28z CAR T 细胞，HA-28z CAR T 细胞表现出更显著的Tex，进一步研究表明，AP-1家族转录因子c-jun表达降低，过表达c-jun后，CAR-T 细胞增殖能力、效应分子分泌能力提升，而分化程度、抑制性受体表达降低，小鼠肿瘤负荷降低。此外，共表达IL-15、抗PD-1 单链抗体，封闭TGF-β信号等方法在一定程度上可改善CAR-T细胞耗竭状态，加速肿瘤清除［41-47］。

5 T细胞耗竭与CAR-T细胞免疫疗法国内外研究现状与前景

基于耗竭性T 细胞对抗肿瘤治疗效果的影响，国内外研究者开始关注Tex 营救，即免疫检查点阻断剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）的应用，如阻断PD-1/PD-L1信号传递，该方法一方面阻断肿瘤细胞诱导的抑制作用，另一方面可逆转PD-1lo 的Tex 祖细胞并促进其成熟分化，发挥杀伤功能［48］。目前，临床常采取的 ICI 靶点包括 PD-1、CTLA-4，主要适应症为恶性黑色素瘤，此外也用于非霍基金淋巴瘤、非小细胞肺癌等研究［49］。2011 年，CTLA-4 特异性抗体Ipilimumab 获FDA 上市批准，临床数据分析显示，5年无复发生存率为40.8%［50］；2014年，PD-1特异性单克隆抗体Opdivo、Keytruda 获批上市，最初用于恶性黑色素瘤治疗，Keytruda 五年生存率达34%［51］。HUANG 等［52］研究发现，PD-1 疗效取决于 T细胞活化效应与患者肿瘤负担。2016 年，PD-L1 单抗Tecentriq 获批用于治疗膀胱癌、非小细胞肺癌治疗等；2018 年，我国首个 PD-1 单抗 Toripalimab 获批上市，其治疗黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤等肿瘤均取得较好反响［53-54］。随后 Sintilimab、Tislelizumab、Cam⁃relizumab 也进入临床试验，拟用于非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、霍基金淋巴瘤等肿瘤治疗。由于耗竭T细胞一般同时表达多个抑制性受体，临床上采取抑制剂联合治疗，常见组合为CTLA-4 与PD-1，治疗恶性黑色素瘤时五年生存率达52%［55］。PD-1 与其他抑制剂联用也在进一步研究中［56-58］。

CAR-T 细胞疗法目前主要用于血液系统肿瘤治疗。2012 年，EMILY WHITEHEAD 在美国宾夕法尼亚大学医院接受肿瘤CAR-T 细胞治疗，目前未复发，成为世界上第一个被CAR-T 细胞疗法治愈的儿童，极大程度推进了细胞疗法在肿瘤免疫中的应用。2017 年，FDA 先后批准 Kymriah、Yescarta 上市，适应证为复发或难治性儿童急性淋巴细胞白血病和复发或难治性大B 细胞淋巴瘤，治疗靶点为CD19，Kymriah 3 个月响应率为81%，12 个月生存率76%［59］。Yescarta完全缓解率可达51%［60］。此外，包括以BCMA、CD20、CD33、CD123 为靶点用于多发性骨髓瘤、急性髓系白血病等研究，同种异体CAR-T细胞申报的临床试验也显示较好疗效［61-62］。国内相关研究积极跟进，2018 年3 月，我国第一个CAR-T细胞疗法临床申请获CFDA 批准，为南京传奇生物申报，以BCMA为靶点，适应证为复发性或耐药性多发性骨髓瘤，总反应率为88.2%，一年总生存率为82.3%［63］。继南京传奇后，上海明聚生物、上海优卡迪生物、复星凯特、银河生物等公司相继开展临床试验。目前，全球登记的CAR-T 细胞治疗临床研究约630项，美国约234项，我国达315项，在研靶点主要以CD19 为主，BCMA 次之。与血液肿瘤相比，CAR-T 细胞疗法在实体瘤研究领域面临更大挑战，登记的在研项目约30 多项，主要靶点为GD2、MUC1、EGFR、Her2 等，此外也有联合 ICI 同时进行治疗的研究［62］。近年细胞免疫疗法在血液肿瘤与实体瘤治疗方面呈明显上升趋势，治疗效果可观，CAR-T 细胞疗法更为显著，后续对CAR-T 细胞治疗的整个流程不断优化，有望为肿瘤患者带来福音。

6 展望

CAR-T 细胞疗法作为目前肿瘤治疗中最具前景的免疫疗法之一，改善其耗竭状态将增强CAR-T细胞功能，提升肿瘤免疫治疗效果。目前，联合治疗成为肿瘤治疗研究热点，在一定程度上呈现“协同效应”，如ICI 与CAR-T，溶瘤病毒（OVs）等两两组合，或前期辅助放化疗、其他抗肿瘤药物。SAMSON等［64］发现，瘤内注射OVs 进行肿瘤微环境预处理，促进胶质瘤周围T 细胞浸润，此外，辅之PD-1 封闭处理，相较于对照组，小鼠肿瘤得到明显改善；经改造后可分泌EGFR 双特异性抗体的溶瘤病毒（OAd-BiTE），与CAR-T 联用促进T 细胞体外活化、增殖及细胞毒性，且在小鼠肿瘤模型中展现较好效果［65］。GULATI 等［66］表明，CAR-T 细胞与 PD-1 抗体联合治疗可加速肿瘤清除，其在MPM 患者体内存留时间长达21 d。最近，NAKAZAWA 等［67］采用CRISPR/cas9技术敲除CAR-T 细胞表面PD-1，其对恶性胶质瘤细胞具有一定抑制作用，而T 细胞自身表型及抑制性受体表达未受影响，进一步体内实验尚待研究。可见，联合治疗的确增强了抗肿瘤效应，未来，CAR-T、ICI、溶瘤病毒三者联用可能成为肿瘤免疫治疗的发展趋势［68］。尽管耗竭性T细胞依然可分泌细胞毒性效应分子，在维持长期肿瘤或感染性疾病中发挥作用，但总的来说其抗肿瘤效应仍是局限的。因此，着力于Tex状态改善，更深入研究CAR-T细胞耗竭，以及与其他抗肿瘤疗法联合治疗将进一步拓展CAR-T 细胞疗法的临床应用，尤其在肝癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤治疗方面。