T细胞与骨代谢①

钱 治 仲泽远 崔元斌 钱 军 禹宝庆（复旦大学附属浦东医院，上海市浦东医院，上海201399）

骨形态发生和重建是成骨细胞合成骨基质与破骨细胞协调骨吸收共同参与的骨内平衡过程。成骨细胞来源于间充质干细胞，破骨细胞来源于造血单核细胞∕巨噬细胞前体。破骨细胞和成骨细胞活动间的不平衡由多种激素变化、炎症或生长因子等的干预引起，从而导致骨骼异常，其特征是骨质疏松症（骨量减少）或骨硬化症（骨量增多）［1］。

适应性免疫的生理学功能有利于调节骨骼系统，然而在免疫功能失调等病理状态下，如免疫缺陷病、感染性疾病的炎症反应等，骨骼系统会随着免疫应答做出相应调整，从而导致骨质疏松或骨折风险增加等后果［2］。随着年龄的增长，骨质流失会自然发生，但在病理状态下，如类风湿性关节炎、骨关节病、强直脊柱炎及HIV∕AIDS等疾病会加快骨吸收，导致骨质丢失［2-3］。生理状态下，如绝经后雌激素缺乏也会导致骨质丢失继而引起骨质疏松［4］。以上疾病状态导致骨丢失的特征都是破骨细胞的骨吸收强于成骨细胞的骨形成［2，5］。

骨免疫学是研究免疫系统和骨骼系统间关系的一门交叉性学科［6-7］。骨髓细胞作为中心造血器官在免疫系统中的作用很早就被认识，然而T淋巴细胞介导的免疫应答和免疫耐受在骨代谢性疾病中的作用并不明确［8］。过去免疫学方面的很多研究主要集中于胸腺、淋巴结、脾脏中的T∕B淋巴细胞等，被认为是适应性免疫的主要区域［9］。近期研究发现，骨髓细胞还可作为记忆性T细胞的主要聚集区［6］。随着动物模型的应用，很多现象和概念得以证实，从而被用来解释人类骨代谢性疾病的机理。基于此，本文综述T细胞与骨相关细胞、内分泌激素、骨代谢性疾病等的关系。

1 骨代谢概述

骨代谢或称为骨重塑，包括骨合成与骨分解。是指各种生理∕机械应力伴随骨骼的不同功能适应而产生的动态平衡结果。这种动态性导致破骨细胞与成骨细胞形成多模式相互作用。骨代谢通过在宿主体内释放钙和磷，导致骨微结构和骨的完整性恢复至新的平衡状态［10-11］。实际上，骨代谢或骨重塑证实了成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的各个阶段均受到调节，这种调节主要包括免疫系统对骨细胞的调节、骨骼的神经内分泌作用对破骨细胞和成骨细胞的直接影响等［12］。雌激素或甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）等激素的激活或微结构的破坏可导致重塑信号的激活，进一步促进骨细胞凋亡，破骨细胞的活性增强，从而促进骨的破坏［13］。破骨细胞凋亡导致的TGF-β水平降低，使破骨细胞的生成成倍增强。破骨细胞前体的激活是蛋白激酶（C∕A）和钙信号传导活性增加的结果，而钙信号传导主要负责骨吸收［14］。在骨重塑部位，由于各种内分泌信号传导或通过骨细胞使破骨细胞前体被成骨细胞募集。此时，成骨细胞过表达单核细胞化学趋化蛋白-1，导致RANKL诱导的破骨细胞生成上调。RANKL主要负责将破骨细胞前体分化和增殖为多核破骨细胞，从而延长成熟破骨细胞寿命。由于破骨细胞与骨表面整合素结合位点（αvβ3整合素分子）的持续黏附，导致出现一个称为“密封区”的孤立环境［1，14］。引起这种偶联现象及促进骨骼形成向骨骼吸收的这种转变的不同机制一直是争议的话题，因为较早的研究报告，骨骼充当这些偶联分子的储存库，并在不同的步骤中相应地释放它们［15］。在逆转阶段，成骨细胞前体分化并分泌导致新骨表面发育的各种分子。在此阶段，MSC将各种因子（如IGF-Ⅰ∕Ⅱ和TGF-β）募集到骨吸收部位。最后，为了获得新形成骨骼的最终形状，羟基磷灰石被整合在这些新近形成的类骨质中［1］。当通过骨细胞发起的信号在骨形成和骨吸收之间达到平衡时，骨重塑进入终止阶段。重塑周期结束时，硬化蛋白表达的丧失促使破骨细胞生成。成熟的成骨细胞恢复为骨质或经历凋亡后分化为骨细胞。为了保持骨骼结构的完整性，皮质骨或骨小梁都需要不断重塑，包括修复由于正常磨损而产生的各种微裂纹［16］。因此，骨骼修复是骨骼重塑的重要一环，发育和维持其作为宿主钙库的功能。

2 T细胞与骨细胞、成骨细胞及破骨细胞

骨骼是一种动态器官，在机体的整个生命过程中处于不断改建或重塑的状态。整个骨改建过程在骨细胞（骨重构的细胞）、成骨细胞（骨形成的细胞）和破骨细胞（骨吸收的细胞）的协调配合下有条不紊地进行［17］。成骨细胞起源于骨髓间充质干细胞［10］。Runt相关转录因子2和靶基因Sp7转录因子负责间充质干细胞向成骨细胞方向转化。此外，Wnt信号通路在成骨细胞的转化形成中也发挥了重要作用，有研究指出，T细胞可促进激活Wnt信号通路［9］。骨细胞是由成骨细胞在碱性磷酸酶作用下骨基质中沉淀而形成［9］。破骨细胞是负责骨吸收的多核细胞。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）是破骨细胞增殖必需的细胞因子，其与活化NF-κB受体的配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）通过肿瘤坏死因子受体相关因子-6（tumor necrosis factor receptor association factor，TRAF-6）负责破骨细胞的诱导和分化［18］。为了维持骨的完整性，成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收需要保持在一个相对平衡的状态［13，19］。

肿瘤坏死因子超家族分子RANKL、TNF相关活化诱导的细胞因子（TRANCE）、破骨细胞分化因子（ODF）、TNFSF11及其受体RANK（TNFRSF11A）是骨重建和调节性T细胞∕树突状细胞信号传递、淋巴结形成的关键调控因子［20］。活化T细胞产生RANKL直接控制破骨细胞的生成和骨改建。通过骨保护素（OPG，TNFRSF11B）抑制RANKL功能，可预防绝经后骨质疏松症和癌症转移中的骨质流失，并阻断各种关节炎模型的骨质流失［1，21］。4-1BB是一种T细胞共刺激分子和TNF受体家族成员，其不仅在天然免疫相关的各种反应中发挥作用，在骨代谢中也发挥作用。研究发现，RANKL诱导的野生型BMM细胞比4-1BB缺乏的BMM细胞中表达更多的IL-10。当4-1BBL被4-1BB-Fc溶解蛋白刺激后，BMM细胞中IL-10的表达明显增加。通过4-1BBL信号，4-1BB和4-1BBL相互作用刺激产生IL-10［22］。因此，在破骨细胞的形成中，4-1BBL起确定性作用，4-1BB敲除小鼠的破骨细胞水平增加可能很大程度上与IL-10的低水平有关。

Ⅱ型干扰素IFN-γ是活化Th细胞的重要产物，对破骨细胞的作用主要通过抗原驱动T细胞活化来实现。实验表明，IFN-γ对破骨细胞的影响可直接以破骨前体细胞作为目标钝化破骨细胞的形成，也可间接通过破骨相关因子RANKL和TNF-γ刺激抗原依赖T细胞活化和T细胞分泌来促进破骨细胞的形成和骨丢失。小鼠模型实验表明，IFN-γ在LPS、感染和去卵巢等条件下可沉默T细胞中的TGF-β信号从而刺激骨吸收和骨质流失。在雌激素缺乏、感染和炎症的情况下，TFN-γ对这两种相反力量的作用结果是偏向于骨吸收的，也就是促进破骨细胞的形成及骨吸收［23］。

综上，T细胞对成骨细胞形成具有抑制作用，而活化T细胞对破骨细胞具有促进作用。TNF和IFN-γ需通过抗原驱动T细胞活化从而发挥对破骨细胞的影响。

3 T细胞与内分泌激素

3.1 T细胞与雌激素 雌激素是人类骨骼新陈代谢的主要的调节器，对骨细胞、破骨细胞、成骨细胞的直接作用分别为抑制骨重构、减少骨吸收和保持骨形成［24］。雌激素同样是成骨∕骨细胞和破骨细胞的T细胞调节器［19，25］。

雌激素缺乏导致的骨丢失，一定程度上是IL-7降低导致的T细胞产生增多所致。实验证明，小鼠卵巢切除术（OVX）后刺激IL-7释放减少，使骨髓来源的祖细胞刺激胸腺依赖性和胸腺非依赖性成熟T细胞的外周扩张，从而使T淋巴生成失调并导致骨丢失［26］。因此，IL-7是上游的关键靶点，雌激素通过IL-7调节造血和免疫功能，对维持骨平衡至关重要。

雌激素缺乏可通过IFN-γ诱导的Ⅱ型反式激活因子引起T细胞增殖和寿命增加，导致骨丢失。研究显示，卵巢切除术后，Ⅱ型反式激活因子的上调源于Th-1细胞介导的IFN-γ增加，导致巨噬细胞分泌IL-12和IL-18增加［25］。上调的IFN-γ介导的反式激活因子导致巨噬细胞抗原提呈增加，增强T细胞活化，延长了活化T细胞的寿命［27］。因此，IFN-γ诱导的Ⅱ型反式激活因子表达的增加与T细胞增殖和寿命的增强对雌激素缺乏导致的骨丢失至关重要。

卵巢切除后雌激素缺乏诱导的骨丢失与骨髓T细胞和间充质细胞SCs等破骨细胞相关因子产生增加相关，由T细胞受体CD40L促使成骨细胞和破骨细胞的形成失调导致。研究发现，T细胞共刺激分子CD40L有利于间充质细胞SCs扩增，促进成骨细胞的增殖和分化，调节破骨细胞形成因子M-CSF、RANKL及OPG产生，并上调破骨细胞形成。CD40L对卵巢切除术后T细胞的活化和刺激TNF的产生也是必需的，在缺乏T细胞或CD40L的小鼠中不能形成骨丢失和增加骨吸收［13］。由此可见，CD40L介导的T细胞与SCs间的串扰在OVX小鼠成骨细胞与破骨细胞的失调中具有双重作用。

雌激素缺乏可诱导骨髓上调TNF产生的T细胞，促使骨丢失发生。体内实验表明，T细胞是体内雌激素缺乏导致的骨丢失的重要机制。卵巢切除后可促进骨髓源性T细胞产生TNF，而不改变每个T细胞TNF的产生。卵巢切除诱导的骨丢失模型的快速建立在野生型小鼠中可以实现，而在TNF敲除的小鼠中却没有形成。而且，卵巢切除诱导的骨丢失在T细胞缺失的裸鼠中是缺失的，可通过野生型小鼠的过继性转移实现，却不能通过T细胞源性TNF敲除的小鼠得以重建［3］。因此，雌激素缺乏导致的骨丢失与T细胞产生的TNF存在因果关联。T细胞产物TNF的上调导致骨髓T细胞数量的增加是体内雌激素缺乏诱导骨丢失的关键机制。

由此得出，雌激素对于人体骨骼系统及免疫系统具有重要作用，雌激素的缺乏可通过降低IL-7、上调IFN-γ及TNF等诱发T细胞增殖，引起骨丢失，导致骨质疏松发生。

3.2 T细胞与甲状旁腺激素 甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）可通过骨髓间充质干细胞和成骨细胞系加强骨代谢，而T细胞则通过CD40L信号加强PTH诱导皮质骨丢失［16］。有研究者用T细胞缺失的小鼠模型，以PTH持续给药的方式模拟甲状腺功能亢进症，并不能诱导破骨细胞形成及骨吸收和皮质骨丢失等效［28］。T细胞为SCs提供了增殖和生存活性，通过CD40L增强了其敏感性。T细胞缺失或T细胞表达的CD40L迟钝后，PTH分解代谢的活性降低了骨髓间充质细胞及RANKL∕OPG的数量，并降低破骨细胞活性［23］。因此，在甲状旁腺机能亢进的过程中，T细胞发挥了非常重要的双重功能，正如其可通过CD40L影响SCs的增殖、寿命和功能。

T淋巴细胞通过Wnt10b信号通路增强了甲状旁腺激素PTH的合成代谢活性。研究发现，T细胞促进骨髓CD8+T细胞产生Wnt10b的产物，有利于淋巴细胞激活经典的成骨细胞Wnt信号通路。为了应对PTH，T细胞缺失的小鼠显示成骨细胞Wnt信号通路减弱及成骨细胞募集、增殖、分化和寿命下调，其结果是骨小梁的合成减弱和长度的不增加［29］。小鼠T细胞Wnt10b的缺失促使淋巴细胞Wnt10b和PTH无合成活性［30］。因此，T细胞介导的成骨细胞的Wnt信号通路在PTH增加骨的强度和长度中发挥双重作用。

特立帕肽是PTH的活性片段（PTH 1-34，C181H291N55O51S2），是骨质疏松症骨合成代谢的治疗药物。其34个氨基酸序列与人体PTH的N端氨基酸序列一致，保持了PTH完整的生物活性［17］。通过间歇性PTH（iPTH）给药方式在小鼠中建模，观察发现特立帕肽和iPTH使小鼠中调节性T细胞（Treg）数量增加2倍［17］。因此，通过诱导iPTH来增加Treg的数量是PTH发挥其骨合成代谢活性的重要机制。

以上研究表明，PTH可通过增加Treg细胞数量作用于成骨细胞，促进骨形成。

4 T细胞与骨代谢性疾病

4.1 T细胞与类风湿性关节炎 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多个关节浸润和系统性骨质疏松为特征性的自身免疫性疾病，以炎症性滑膜炎为特征，伴有关节软骨和骨的破坏。T淋巴细胞活化是RA的标志，并以CD28作为效应接收器［31］。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig（cytotoxic T lymphocyte antigen 4-Ig，CTLA4-Ig）共刺激物CD28抑制剂可促进骨的合成代谢，改善骨质疏松。有研究者用C57BL6小鼠建立RA模型，以CTLA4-Ig治疗，发现CD28 T细胞共刺激分子可显著促进骨形成和增加骨微结构，同时促进了T细胞中合成代谢因子Wnt10b的 分 泌［32］。因 此，CTLA4-Ig共 刺 激 物CD28抑制剂促进了T细胞Wnt10b的产生和骨形成，同时在骨质疏松状态下可促进骨形成的合成代谢。

衰老的T细胞在RA模型中可促进骨丢失。T淋巴细胞的衰老与类风湿性关节炎间是否相关目前尚未明确，但衰老CD4+T细胞的堆积（聚集）是类风湿性关节炎的重要标志［19］。有研究者通过双能X线检查发现，相较于正常人群和非类风湿性关节炎的病人，RA患者骨量减少的同时出现了CD4+CD28-细胞汇聚现象。相较于CD28+细胞，CD4+CD28-细胞中RANKL高表达，以IL-15刺激可出现RANKL表达上调，其中在CD28-细胞中尤其明显［31］。因此，CD4+CD28-细胞比CD28+细胞更能促进破骨细胞形成。

RA滑膜组织产生多种细胞因子和生长因子，可增加破骨细胞的形成、活性和存活率，包括IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-11、IL-17和M-CSF［31］。RANKL是破骨细胞分化和增强T细胞∕树突状细胞协同作用的重要因素。RA滑膜的CD4+T细胞和滑膜成纤维细胞是RANKL的来源［33］。此外，骨保护素（osteoprotegerin，OPG）是RANKL的诱饵受体，通过阻滞可保护骨骼不受破坏［21］。有研究者使用血清转移模型在RANKL敲除小鼠体内形成关节炎，尽管炎症仍在持续，但通过Micro-CT和病理学分析发现，关节炎RANKL敲除小鼠和对照组小鼠均出现软骨损伤，RANKL敲除小鼠软骨损伤较轻，且骨侵蚀程度与对照组相比显著降低［33］。

综上，CD4+T细胞是RA的炎症性滑膜炎形成、软骨及骨破坏的关键因素，且衰老CD4+T细胞作用更甚。CTLA4-Ig对缓解骨质破坏具有积极作用。因此，动态检测CD4+T细胞与CTLA4-Ig指标可为RA的诊断及治疗提供一定的实验室支持。

4.2 T细胞与骨关节炎OA是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等［34］。

活化T细胞通过RANKL与其诱饵受体骨OPG调节关节炎中骨丢失和关节破坏。骨改建和骨丢失被TNF家族分子RANKL和其诱饵受体OPG控制在一个相对平衡状态［21］。此外，OPG调节淋巴结器官形成、免疫系统T淋巴细胞和树突状细胞的发展和相互作用。RANKL在软骨细胞、成骨前体细胞、成熟的成骨细胞中表达［21］。OPG在T细胞中的表达受抗原受体募集，说明活化T细胞可通过OPG和RANKL影响骨代谢。体内T细胞的系统性激活将导致RANKL介导的破骨细胞形成和骨丢失。在T细胞依赖性的小鼠关节炎模型中，通过骨保护素阻断RANKL可防止骨和软骨的破坏，但不能抑制炎症［35］。因此，T细胞活化可导致RANKL的产生和骨丢失。

异常的T细胞免疫促进炎症细胞因子如TNF-α的异常表达，导致自身免疫性关节炎中破骨细胞介导的骨侵蚀和骨质疏松形成。实验发现，破骨前体细胞通过诱导一种RANK的共刺激受体成对Ig样受体A（paired Ig-like receptor-A，PIR-A），促进破骨细胞形成并使得TNF-α有利于炎症性骨丢失［15］。

由上可知，在骨关节炎的发病过程中，活化T细胞或异常T细胞的免疫应答可诱发关节炎中的骨丢失和骨破坏。根据T细胞的状态可判断骨关节炎的骨侵蚀和骨丢失情况，为进一步治疗提供参考。

4.3 T细胞与骨质疏松症 骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由于破骨细胞的骨吸收超过了成骨细胞的骨形成所导致的骨丢失的一种很常见疾病，是机体内骨平衡状态被打破后的一种骨代谢性疾病［7］。临床上OP的定义为骨矿物质密度（BMD）T值≤−2.5个标准差［36］。分子生物学上OP是指由于骨矿物质密度和骨微结构完整性改变，从而导致骨的负荷减小及骨折风险增加的一种疾病状态［37］。

骨重塑是骨细胞和骨髓细胞间相互作用的动态平衡过程。来源于骨髓的淋巴细胞及其亚组在骨重塑过程中发挥很重要作用。T细胞中具有代表性的是CD4+T和CD8+T细胞［38］。CD4+T细胞在免疫的功能和维持上发挥很重要作用，可帮助B细胞产生抗体和其他免疫细胞的功能［9］。天然CD4+T细胞可在适宜环境刺激下分化为Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg、滤泡辅助性T细胞TFH等［39］。Th17主要负责启动和刺激骨吸收，而Treg则与抑制骨吸收有关。因此，并不是所有T细胞都与破骨细胞的发生相关［37］。近期研究表明，CD8+T细胞具有骨保护作用，可以抑制骨丢失［38］。CD8+T细胞抑制破骨细胞的发生是通过分泌可溶性的因子，如OPG和IFN-γ来调节骨密度［40］。在不同的病理和炎症状态下，活化T细胞通过RANKL和TNF-α促进骨质破坏，可以耗竭CD4+T细胞和CD8+T细胞，导致OPG的产生降低［38］。很多研究发现，T细胞缺失的裸鼠的骨密度保持在正常或较高的水平［41］。因此，T细胞对骨改建具有重要作用。

T辅助细胞（Th）亚群（Th1∕Th2∕Th17）和Treg的不平衡有助于OP的发病机制。据报道，Th17∕Treg平衡受损可导致炎症性疾病的发生。有研究者用双磷酸盐治疗OP患者，发现经治疗的OP患者血浆IL-6、IL-17、IL-23和IFN-γ均显著降低，IL-4、IL-10、TGF-β和IL-12水平较对照组升高。由此推测，Th17细胞因子级联（IL-6、IL-17和IL-23）的显著减少和Treg细胞因子级联（IL-10和TGF-β）的升高是由Th17∕Treg失衡所致［42］。雌激素缺乏导致的OP可能与Th1∕Th2细胞有关。有研究者将小鼠分为年轻组（Young）、假手术组（Sham）、去卵巢组（OVX）和自然衰老组（Aging），使用不同剂量的Catalpol或对照品进行处理，结果表明，BMD、E2水平与Th2亚群比例呈正相关，与Th1亚群比例、Th1∕Th2呈负相关。Catalpol促进Th2特异性转录因子表达，抑制Th1相关转录因子表达［43］。Th17细胞是Th细胞的一个新的亚群，可选择性地分泌几种促炎细胞因子，尤其是IL-17［44］。已证实Th17细胞对炎症性疾病动物模型的破骨细胞生成具有促进作用，并可加速骨质流失。靶向Th17细胞或IL-17可抑制RA的骨吸收［45］。因此，推测Th17细胞可能是治疗骨质疏松症的潜在靶点［46］。最近研究发现，Treg可通过分泌TGF-β、IL-10、IL-4和CTLA-4调节破骨细胞分化［47］。CTLA-4可通过介导应答T细胞阻断体内外依赖性CD80和CD86共刺激分子的产生，降低对Treg抑制的敏感性，从而促进破骨细胞的凋亡［48］。Treg介导免疫抑制功能，如自身免疫。研究表明Treg可分泌外泌体，发挥免疫调节作用，并参与感染免疫、器官移植、超敏反应、自身免疫病及肿瘤的发生与发展［49］。Treg也可以影响非免疫过程，如骨内稳态［50］。因此，Treg可在体外和体内抑制破骨细胞分化。

综合上述，CD4+T、Th1、Th1∕Th2、Th17等增多会增强破骨细胞活性，而CD8+T细胞、Treg、CTLA-4等增多则有抑制破骨细胞的作用。因此，动态检测CD4+T、CD8+T、Th1∕Th2、Th17、Treg等指标可对明确OP的诊断及治疗提供客观的实验室证据。

5 总结

T淋巴细胞对骨骼系统的影响是多元且复杂的。其对研究者认识和研究骨代谢疾病提供了一种新的方法和途径，也为骨免疫学的发展指明方向。本综述从细胞层面、激素层面及骨代谢疾病层面分析了T淋巴细胞的双重作用。然而，骨代谢性疾病的研究层次尚浅，从有限的疾病模型中虽然看到了一些现象，但更深入的机制探讨仍任重道远。辅助性T淋巴细胞中的部分亚群对骨代谢具有一定作用，但是否所有亚群都有作用；目前没有报道的亚群是否同样存在一正一反的双重作用；T细胞的研究主要集中在破骨细胞方面，对成骨细胞、软骨细胞、骨细胞等的研究仍缺乏进一步报道。虽然T细胞与骨代谢性疾病的相互关系尚缺乏深入研究，但通过不同的骨代谢性疾病模型的研究，已初见T细胞在骨代谢中的端倪，通过改变骨代谢疾病中T细胞及其亚群的表达水平，或改变T细胞或其亚群的表达而诱导骨代谢相关基因或信号的改变，进而诱导骨代谢相关生物学行为的改变，都将成为临床治疗骨代谢性疾病的新思路。深入研究T细胞及其亚群的基因调控或信号转导等在骨代谢疾病中的作用，有助于阐明骨吸收或骨形成的机制，为骨代谢性疾病的研究或治疗拓宽思路。