25-羟基胆固醇的免疫调控作用及其对结核肉芽肿形成的意义①

周 爽 李 丹 宋璟瑞 闻 馨 杜德兵 王德成

（三峡大学医学院，三峡大学感染与炎症损伤研究所，宜昌443002）

1 概述

胆固醇在人体中具有多种生理功能，不仅参与细胞膜形成，还是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的原料。在脂质脱氢酶和氧化酶的催化下，胆固醇环或侧链上添加羟基形成一系列氧化衍生物，称为氧固醇。早期认为氧固醇的代谢只是一种简单的生物转化，增加极性，利于体内消除；上世纪90年代以来，通过对动脉粥样硬化（atherosclerosis，ATH）的深入研究，发现内含大量氧固醇，从而引起研究者对氧固醇的重视［1］。后来发现，氧固醇也是孕烯醇酮和甾体激素合成的中间体，且其还能与特定的受体相互作用，识别信号通路［2］。近年发现，氧化的胆固醇比未氧化的胆固醇更有助于免疫反应［3］。25HC（25-hydroxycholesterol，25HC）属于众多胆固醇氧化物中的内源性氧固醇，是巨噬细胞产生并分泌的唯一氧固醇，其在不同生物学过程中发挥重要免疫作用，包括抗病毒效应、调节炎症反应、信号转导等［4］。CH25H（cholesterol 25-hydroxylase）是一种干扰素刺激基因的表达产物，是一种内质网相关酶，可催化胆固醇生成25HC［5］。体内与体外研究发现，结核感染时细胞内CH25H∕25HC通路异常高表达［6-7］。结核患者肉芽肿区域存在丰富的泡沫细胞，且最近一项研究发现，体内或体外25HC均能诱导泡沫细胞产生［8-9］。提示25HC可能介导泡沫细胞参与肉芽肿的形成，而CH25H∕25HC通路在结核肉芽肿中的作用目前未见报道。因此本文将讨论25HC的免疫作用的进展，并重点讨论25HC在结核肉芽肿形成过程的作用。

2 25HC的免疫调控作用

2.1 25HC的抗病毒效应 25HC具有明显的抗病毒效应，但其作用机制目前尚无定论。病毒感染会刺激细胞产生干扰素（interferons，IFNs），Ⅰ型和Ⅱ型IFNs能够上调CH25H蛋白表达，CH25H主要通过其催化产物25HC来抵抗病毒入侵。Zika病毒感染细胞后，细胞内CH25H和25HC的水平显著上调，25HC插入到病毒感染的细胞膜，降低细胞膜流动性，阻断病毒介导的细胞之间的膜融合，抑制病毒进入细胞［10］。研究显示，过表达CH25H或用25HC处理细胞可抑制包膜病毒的复制，包括埃博拉、艾滋病病毒、水疱性口炎病毒及鼠疱疹病毒68等［11］。也有研究者认为，25HC是通过影响蛋白质复制、对其进行化学修饰，从而阻止病毒复制［12］。CH25H抵抗拉沙热病毒的机制，便是通过影响GP1蛋白的糖基化来阻碍病毒与宿主受体的吸附，从而抑制病毒的入侵［13］。此外，氧固醇还可能激活综合应激反应，这种反应会激活转录重组，抑制蛋白质合成，从而抑制病毒复制［14］。最新研究发现，猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒还能通过泛素-蛋白酶体途径降解CH25H，进一步说明CH25H∕25HC具有重要的抗病毒作用［15］。

2.2 25HC调节炎症反应 炎症是十分常见的基本病理过程，抗炎和促炎因子维持平衡才能使机体既有效抵御致病因素的侵袭，又使炎症反应不至于过度强烈而损伤机体正常功能。在Toll样受体的配体和Ⅰ型IFNs刺激下，巨噬细胞和树突状细胞均可表达大量的CH25H；CH25H可抑制B细胞中IgA产生，也可诱导巨噬细胞中促存活因子表达而促进胞内细菌生长［16］。缺乏CH25H表达的巨噬细胞则会分泌更多的IL-1家族细胞因子［5］。25HC还能通过阻断固醇调节响应元件结合蛋白的激活，抑制炎性体活动和后续的IL-1β的产生［5］。

研究发现慢性阻塞性肺疾病患者痰液中25HC的表达水平增加［17］；25HC能增加核因子κB的DNA结合活性，最终导致IL-8和IL-6释放增多［18］。用25HC处理小鼠巨噬细胞时，趋化因子CCL5在培养基中呈剂量依赖性释放［19］。25HC还是一种与整合素生理相关的激活因子，参与调节炎症反应［20］。此外，缺乏25HC的小鼠因其炎症病理损伤减轻导致存活率增加，证实25HC具有放大炎症信号的作用［21］。以上结果表明，25HC的炎性调节作用比较复杂，其既能促进炎症发生，也能抑制炎性损伤，提示其在炎症反应调节中的精细与微妙作用。

2.3 25HC参与信号转导 25HC是高效的肝X受体（liver X receptor，LXR）的配体，能激活LXR［22-23］。25HC能通过LXR增加胆固醇逆向转运体ATP结合转运体A1和ATP结合转运体G的活性，抑制巨噬细胞和其他外周细胞中的胆固醇积累［24］。研究发现，25HC通过糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）信号通路介导了血管紧张素Ⅱ诱导的肌肉萎缩，小鼠腹腔注射25HC后，肌肉萎缩素1和肌肉特异性环指蛋白1的表达上升，并抑制了IGF-1∕Akt信号通路，激活了GSK3β信号通路［25］。最近一项研究发现，对氧化固醇结合蛋白2的抑制显著增加25HC的水平，25HC通过p53∕SREBF2∕NFYA信号传导途径也能下调氧化固醇结合蛋白2的表达［26］。此外，25HC经过CYP7B1催化后的产物7α，25-二羟基胆固醇（7α，25-dihydroxycholesterol，7α-25HC），是EB病毒诱导受体2（Epstein-Barr virus induced receptor 2，EBI2）的强效配体，而EBI2∕氧甾酮信号通路对适应性免疫反应非常重要［27］。EBI2在维持B细胞准确定位中具有举足轻重的作用，仅毫微摩尔的7α-25HC即可使激活的B细胞产生强烈的迁移反应［28］。此外，7α-25HC与EBI2的相互作用还能促进激活的CD4+T细胞迁移到炎症组织［29］。虽然7α-25HC是否只能由25HC生成尚不明确，但目前发现其只能在有25HC的区域生成［30］。

3 25HC促进泡沫细胞的形成

泡沫细胞是含有丰富脂质的巨噬细胞，巨噬细胞对死亡细胞及病原体的清除吞噬使巨噬细胞中含有大量的胆固醇等脂质，丰富的胆固醇会刺激乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶，形成胆固醇酯，以脂滴的形式在细胞质中储存［31］。在Toll样受体的激活，及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和单核细胞趋化因子CCL2等促炎因子的持续刺激下，巨噬细胞通过调节血清中低密度脂蛋白颗粒的流入和流出间的平衡转化为泡沫细胞［32-33］。泡沫细胞最常见于ATH，胆固醇在动脉内膜沉积，泡沫细胞在血管中出现。人体中氧固醇与ATH的形成密切相关，ATH斑块中含有大量的泡沫细胞和氧固醇，包括25HC；而激活转录因子3（activating transcription factor 3，ATF3）通过与ch25h基因的启动子直接结合，抑制ch25h的转录与表达，导致泡沫细胞生成减少［9］。以上结果证实，25HC能诱导泡沫细胞生成。SOTTERO等［34］证实25HC能诱导IL-8及多种细胞因子的产生，最终导致ATH形成。在ATH病理过程中，泡沫细胞的形成在很大程度上是由25HC介导的。神奇的是，LATHE等［35］发现阿尔兹海默症与血管粥样硬化这两种看似毫无关系的疾病竟有紧密联系。与ATH患者病变相似，阿尔兹海默症患者大脑内血管壁明显增厚，氧固醇、胆固醇前体和类固醇含量增多，并在大脑神经元发生退化区域测得高表达的Ch25hmRNA，提示此处高表达的Ch25hmRNA与增厚的血管壁可能密切相关。

越来越多的研究发现，与ATH巨噬细胞中脂质的渐进式积累与转化相似，结核患者肺肉芽肿的脂质含量比未感染的肺组织明显增加，结核肉芽肿内存在大量泡沫细胞［36］。研究报道，结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染可导致小鼠泡沫巨噬细胞内Ch25h转录水平和蛋白质水平均升高，且CH25H可使胆固醇脂质含量增加，促进MTB在巨噬细胞内的生存［37］。目前认为，25HC通过抑制胆固醇酯的水解，减少细胞内游离胆固醇的形成，抑制低密度脂蛋白受体的表达，促进泡沫细胞的形成［38］。25HC促进泡沫细胞生成的详细机制还有待进一步深入研究。

4 25HC介导泡沫细胞参与结核性肉芽肿形成

4.1 泡沫细胞参与结核性肉芽肿形成 肺结核由MTB引起，经呼吸道传播，结核病作为严重危害人类健康的慢性传染病，治疗效果却并不理想。结核从潜伏期、亚临床感染发展为活动性疾病，最终导致感染性杆菌的传播，这一过程可从肉芽肿水平来局部地确定病情进展。因此，了解肉芽肿的形成过程，对了解感染的进展演变至关重要。结核性肉芽肿是细菌与宿主感染部位的细胞局部相互作用的结果，意味着免疫系统对感染的抑制，这是一个“僵持”的时期，在此期间，细菌的数量保持相对稳定，主要是一群非复制状态的杆菌维持在“潜伏期”。肉芽肿对病灶既可进行局部灭菌，也可形成局部坏死，液化形成空洞导致感染性细菌在呼吸道扩散。小鼠感染结核菌后，早期的肺组织没有任何损伤，组织反应相对稳定，但上皮细胞和固有层之间的细胞数目增加［39-40］。没有细菌细胞壁或细菌基因组等碎片堆积，表明细菌数量仍然相对稳定［41］。当易感宿主吸入结核杆菌，肺泡巨噬细胞就会将其吞噬并激活，激活后的巨噬细胞释放TNF、炎症因子和趋化因子，肉芽肿的形成需要持续的TNF信号传导来维持细胞招募和趋化因子浓度［42-43］。巨噬细胞、树突细胞和淋巴细胞进入感染部位，随后巨噬细胞分化成几种不同的形态，包括多核巨细胞、上皮样细胞和充满脂滴的泡沫巨噬细胞［44］；接着结构更加分层，泡沫细胞进一步增多，成纤维细胞等围绕在巨噬细胞层外，并将淋巴细胞排除在外，形成一个多细胞聚集的慢性炎症区域，继而发展为泡沫细胞丰富的肉芽肿［45］。

在MTB感染初期，巨噬细胞内的吞噬体内有多个杆菌，称其为早期脂质体［46］。当感染的巨噬细胞慢慢出现在肉芽肿周围时，早期脂质体形态发生变化，慢慢失去了甲苯胺蓝染色阳性的特性，这种失去染色阳性的脂质体的出现即标志着泡沫细胞生成［46］。结核性肉芽肿的一个显著特点是吞噬细菌的巨噬细胞分化为脂质丰富的泡沫细胞。脂质是胞内MTB生长所必需的，其在肉芽肿微环境下能够利用的营养有限，因此脂质丰富的泡沫细胞则成为保证细菌生长的重要物质。将胆固醇用放射性碳（C14）标记追踪，发现环上的碳转化为二氧化碳（CO2），而侧链上的26位碳被MTB吸收到其膜脂中，包括细胞壁上一种叫作PDIM（phthiocerol dimycocerosates）的脂质成分［47］。这证明泡沫细胞对MTB在肉芽肿中的生存有重要作用。肉芽肿内泡沫细胞位于肉芽肿中干酪样坏死中心与淋巴细胞的交界处，紧密围绕在坏死中心周围［48］；而干酪样坏死组织成分主要为胆固醇、胆固醇酯及磷脂等，与泡沫细胞中的脂质成分基本一致［49］。泡沫细胞在肉芽肿内的位置及其胞内脂质成分，都证明泡沫细胞在肉芽肿形成及发展过程中发挥重要作用。

4.2 25HC介导泡沫细胞参与结核性肉芽肿形成CD4+T细胞是MTB感染的关键免疫调节细胞，结核感染患者与健康对照者相比，其CD4+T细胞内CH25H表达显著增高，25HC含量也明显增加，而且在活动性肺结核患者体内升高更明显［50］。体外研究显示，减毒菌株（细胞壁有缺陷）与野生型MTB感染的巨噬细胞内CH25H表达水平都明显增高，25HC含量也显著增加，尤其是野生型MTB［7］。以上结果显示，结核感染时免疫细胞内CH25H∕25H通路在体内体外均表现为异常高表达。肉芽肿是MTB感染后形成的特征性标志物，也是结核病理诊断标志物。大量研究证实泡沫细胞参与肉芽肿形成的全过程，为细菌提供碳源，并成为细菌抵御外界不良因素的屏障，保障细菌在肉芽肿内稳定的生存。泡沫巨噬细胞保证细菌的持续感染，介导肉芽肿形成的关键。因此，在结核感染期间发生的巨噬细胞脂质代谢改变可能与感染进展有关，通过减少泡沫细胞的生成，可能有助于控制肉芽肿的形成。以上结果提示，25HC可能通过介导泡沫细胞参与肉芽肿的形成，其具体作用机制还有有待进一步研究。

5 总结与展望

结核病是一种慢性消耗性疾病，是一种特殊的炎症，目前治疗结核病的宿主导向疗法旨在达到最大限度杀死细菌的同时，尽可能减少炎症所致组织损伤［51］。MTB感染宿主后，生成大量泡沫细胞，泡沫细胞不仅为结核菌提供营养和能量，还能助其抵御外界不良环境，保证结核菌在肉芽肿内的潜伏和持久性。因此，可通过抑制泡沫细胞的生成抑制MTB生长。实际上，在结核病治疗最新进展中，已有研究表明，他汀类药物（降脂类药物，可减少分枝杆菌形成的脂滴）与标准方案联用能加快小鼠肺部细菌的清除速度［52］。肉芽肿能保护机体，控制MTB感染，限制细菌在体内播散。面对环境变化时，肉芽肿中心坏死液化，细菌再活化并传播。那么是否可以通过对肉芽肿进展的把握来控制结核病情的进展，并进行诊断治疗？通过调控CH25H∕25HC介导泡沫细胞参与肉芽肿的形成，将有助于为研究结核病发病机制提供新线索，发展迫切需要的新的抗结核感染的治疗方法，以及提供新的有效的临床诊断标准。然而，25HC参与结核性肉芽肿形成的机制仍需深入研究。