内质网-线粒体接触与抗病毒免疫应答①

沈娱汀 李 娟 宋 云 方 亮 陈丽华（空军军医大学基础医学院免疫学教研室，西安710032）

内质网是细胞质中一个与细胞基质相隔离，但彼此相通的囊腔和细管系统。早在1945年，PORTER等用电镜观察小鼠成纤维细胞时发现了细胞中的分支相互连通的立体网状结构，称之为内质网。根据内质网膜上是否附着核糖体，可将其分为粗面内质网和滑面内质网。粗面内质网上附着有大量核糖体，为蛋白质和多肽链的加工合成提供场所；而滑面内质网膜上无核糖体附着，无法合成蛋白质，但与糖类、脂质的合成作用有关，并参与脂质的运输［1］。线粒体是真核细胞有氧呼吸的主要场所，参与能量转化、三羧酸循环和氧化磷酸化等反应。同时，线粒体可以储存由内质网转运过来的Ca2+，从而控制细胞中的钙稳态。透过电子显微镜观察到，内质网与线粒体之间的距离十分微小，滑面内质网与线粒体外膜之间的距离为10 nm，粗面内质网与线粒体外膜之间的距离为25 nm［2］。人们将内质网与线粒体之间的结构域称之为内质网-线粒体接触，其在调节细胞Ca2+稳态、磷脂合成、细胞凋亡、线粒体动力学以及内质网应激等方面均发挥着重要的作用［3-4］。除此之外，越来越多的蛋白质被证明参与内质网-线粒体接触，提示敲除或诱导这些蛋白的表达可能会影响细胞的一系列生物学功能［5］。本文将对内质网-线粒体接触方式以及此结构调控抗病毒反应的相关性研究进行综述，以期为抗病毒治疗提供新的靶点与方向。

1 内质网-线粒体接触

内质网-线粒体接触是线粒体外膜与内质网膜之间相互接近并且相互作用的结构域，在多种生理过程中发挥着重要作用。目前，人们发现内质网与线粒体之间并不是直接相互接触的，而是需要通过许多蛋白或蛋白质之间的相互作用来实现，包括：线粒体融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）、三磷酸肌醇受体（inositol triphosphate receptors，IP3R）与电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）之间相互作用、囊泡相关膜蛋白相关蛋白B（vesicle-associated membrane protein-associated protein B，VAPB）与蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（protein tyrosine phosphatase interacting protein-51，PTPIP51）相互接触以及B细胞受体相关蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，Bap31）与线粒体裂变蛋白1（Fission 1 homologue，Fis）之间的相互作用等。

1.1 Mfn2在内质网-线粒体接触中的作用 在哺乳动物细胞中，Mfn2存在于线粒体外膜和内质网表面。通过共聚焦显微镜，研究者观察到Mfn2水平降低时，内质网与线粒体之间的距离相应增加［6］。但FILADI等［7］通过透射电子显微镜发现，在Mfn2-∕-小鼠的胚胎成纤维细胞中，内质网-线粒体接触的数目多于野生型（wide type，WT）小鼠，当敲除WT小鼠的Mfn2后，内质网-线粒体接触数目增加，同时Ca2+从内质网向线粒体的转运增强［8］。作者认为，造成这两种相反结果的原因可能是透射电子显微镜评估的是细胞器之间接触的数量和大小，而荧光显微镜通常测量的是内质网与线粒体的重叠面积或体积。当Mfn2敲除后，线粒体肿胀碎裂，形态发生明显改变，并且所占细胞面积减少，因此通过荧光显微镜容易观察到内质网与线粒体接触水平降低。事实上，内质网-线粒体的接触数量不但没有减少，反而呈增高趋势。

1.2 IP3R-VDAC与Ca2+转运IP3R是位于内质网膜上的三磷酸肌醇依赖性钙通道，当细胞外可溶性激动剂与G偶联蛋白受体结合时，磷脂酶Cβ（phospholipase Cβ，PLC）被激活，由磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinositol 4，5 bisphosphate，PIP2）水解产生肌醇-1，4，5-三磷酸（inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3）［5］。IP3与其在内质网上的受体结合并诱导其开放，从而介导内质网中Ca2+的释放［9］。VDAC是一个广泛存在于线粒体外膜的分子，高等多细胞生物和哺乳动物具有三种不同类型的VDAC（VDAC1、VDAC2、VDAC3），其中VDAC1最具有代表性。研究表明，IP3R与VDAC并非直接接触，而是需要通过位于线粒体基质中的葡萄糖调节蛋白75（Glucose regulated protein 75，Grp75）连接促进内质网-线粒体相互作用［10］。

细胞质、内质网和线粒体中Ca2+浓度分别约为100 nmol∕L、1 000 μmol∕L和1 000 nmol∕L，线粒体钙单向转运蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是一种位于线粒体内膜上的高选择性离子通道，介导Ca2+通过MCU穿过线粒体内膜进入线粒体。因此，IP3R-Grp75-VDAC-MCU钙调节轴在维持细胞内Ca2+稳态中发挥重要作用［10］。

最近，BARTOK等［11］研究发现IP3R1大部分粘附在细胞表面，而IP3R2和IP3R3在细胞中的分布更加均匀，不同亚型的IP3R对于Ca2+从内质网到线粒体的转运速率不同（IP3R2＞IP3R3＞IP3R1）。同时，IP3R2与IP3R3在细胞中的主要作用是促进Ca2+从内质网到线粒体的快速转运，IP3R1的主要作用是维持Ca2+在内质网与线粒体之间的转运。然而值得注意的是，无论是在内质网和线粒体之间形成紧密相互作用方面，还是在调节细胞器的亚细胞分布方面，IP3R的作用均不依赖于Ca2+的转运。

1.3 VAPB-PTPIP51调控内质网-线粒体接触 内质网蛋白VAPB与线粒体蛋白PTPIP51的接触在内质网与线粒体的相互作用中同样发挥重要作用。通过透射电子显微镜观察到，过表达的VAPB或PTPIP51可使内质网与线粒体接触更加紧密；而当用siRNA敲除VAPB或PTPIP51时，接触变得更 加 松弛，并促进自噬体的形成［12］。同时，人工连接内质网和线粒体降低了自噬体水平，说明VAPB-PTPIP51对自噬体形成的调节是通过调控内质网-线粒体接触来完成的［13］。

VAPB-PTPIP51间相互作用还可以调节Ca2+从内质网向线粒体的释放［14］；过表达或siRNA敲除VAPB和PTPIP51影响内质网-线粒体接触导致IP3R与VDAC之间的相互作用发生改变，进而影响IP3R依赖的线粒体对Ca2+的吸收。有趣的是，这些变化并不涉及IP3R、VDAC以及MCU表达水平的改变。同时，当阻断IP3R介导的Ca2+从内质网向线粒体转运时，VAPB-PTPIP51过表达对自噬体形成的抑制作用被完全消除［13］。

PTPIP51除了能与VAPB相互作用以外，GALM-ES等［15］通过免疫共沉淀实验证明，在内质网上，氧化固醇结合蛋白家族（oxysterol-binding protein（OSBP）-related proteins，ORPs）ORP5∕8通 过 其ORD结构域中的磷脂转移同样可以与PTPIP51结合，在维持线粒体形态与呼吸方面发挥重要作用，但其具体机制还不清楚。

1.4 Bap31-Fis与细胞凋亡 凋亡诱导因子刺激时，多功能分选蛋白2（multifunctional sorting protein 2，PACS-2）与去磷酸化的BH3结构域凋亡蛋白（BH3 interacting death agonist，Bid）结合，并将其运输至线粒体中。Bid蛋白最终被切割成为截短型Bid片段（truncated Bid，tBid），从而导致细胞色素C的释放，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，caspase-3）的激活和细胞凋亡［16］。但如何将凋亡信号逆向从线粒体传入内质网，作者并未在文中阐明。IWASAWA等［17］在用Fis转染HeLa细胞以及在用siRNA敲除广泛表达于内质网的Bap31时发现，Bap31中的死亡效应域的变异为procaspase-8的活化提供平台。Fis与Bap31相互作用，通过procaspase-8促进其分裂为促凋亡的P20Bap31，从而将凋亡信号从线粒体传递至内质网。

1.5 其他蛋白对于内质网-线粒体接触的影响 随着对内质网-线粒体接触的深入研究，越来越多的蛋白或蛋白之间的相互作用被证明参与调节内质网-线粒体接触，进而调控机体的代谢等生理反应。如：内质网-线粒体接触位点上的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）以及糖 原 合 酶 激 酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的亚细胞分布促进己糖激酶I（hexokinase I，HK-I）向VDAC的募集，进而支持记忆CD8+T细胞快速获得发挥其效应功能所需的代谢能量［18］；FUN14相 关 蛋 白1（FUN14 domain containing 1，Fundc1）定位于内质网-线粒体接触部位，与IP3R2结合介导IP3Rs依赖的Ca2+从内质网向线粒体或肌浆的释放。Fundc1缺陷细胞内Ca2+水平降低抑制Fis表达，进而破坏线粒体分裂，导致线粒体功能障碍［19-20］；内质网伴侣蛋白Sigma-1同样定位于内质网-线粒体接触部位，与另一内质网伴侣蛋白Bip结合。当内质网管腔Ca2+浓度降低导致IP3Rs开放后，Sigma-1和Bip解离并与IP3R3结合，从而减少Ca2+转移并防止蛋白酶体降解［9］。

2 内质网-线粒体接触与抗病毒免疫应答

病毒是由核酸和蛋白质外壳构成的介于生命和非生命之间的一种物质，需要依赖寄生于细胞中存活。病毒处于细胞外环境时，其复制并不活跃，但具有感染细胞的能力。当病毒进入细胞后，则解体释放核酸分子，借助细胞内的物质进行自我复制。同时，为了抵抗和消除病毒的感染和破坏，机体将启动抗病毒免疫应答。研究表明，内质网-线粒体接触参与调节机体的抗病毒免疫应答过程。

2.1 内质网-线粒体接触与抗RNA病毒免疫应答RNA病毒是一种以核糖核酸为遗传物质的病毒，包括大部分植物病毒（如烟草花叶病毒）和少量动物病毒（如HIV）。与DNA病毒相比，RNA病毒更加容易致病及突变，因此种类更多，难以研制有效疫苗。固有免疫应答是机体在发育和进化过程中形成的天然免疫防御措施，当宿主细胞受到病毒的攻击时，细胞内的模式识别受体（pathogen recognition receptors，PRRs）识别病毒的病原相关分子模式（pathogen associated-molecular patterns，PAMPs）从而启动固有免疫应答。细胞中经典的PRRs分为Toll样受体、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLRs）以及视黄酸诱导基因Ⅰ（RIG-1）样受体（RLRs）。研究表明RLRs主要在细胞质中与病毒RNA结合［21］，包括了RIG-1和黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA-5）。当RNA病毒感染时，RIG-1和MDA-5中的两个Caspase募集结构域（caspase recruitment domains，CARDs）与线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）的CARDs结构域相互作用，在K63多泛素链存在的情况下将内源性MAVS转化为有功能的MAVS信号复合体，MAVS复合体募集TRADD、FADD、Ripk-1、cFLIPL和Caspase-8等多种信号分子，从而激活起始κB激酶（IKK）相关的TANK结合酶1（TBK1）［21-23］。IKK激活NFκB促进促炎因子的形成，TBK1诱导干扰素调节因子3∕7（interferon regulatory factor，IRF3∕7）磷酸化进而激活Ⅰ型干扰素（interferon，IFN），两者均可抑制病毒的复制及组装［24］。

2.1.1 Mfn2与MAVS调节抗病毒免疫应答MAVS定位于线粒体外膜，但也存在于过氧化物酶体和内质网-线粒体接触部位，可以协助宿主对RNA病毒感染产生固有免疫应答［25］。免疫共沉淀结果表明，Mfn2和MAVS的相互作用取决于MAVS在线粒体上的定位，其主要发生在Mfn2的中央疏水七肽重复序列（HR1）和MAVS的C-端区域之间［26］。过度表达 的Mfn2抑 制RIG-1、MDA-5以 及MAVS介 导 的IRF3和NF-κB的活化；敲除Mfn2可以增加病毒诱导的IFN-β的产生，从而减少病毒复制［27］。但是，调节内质网-线粒体接触，通过改变Mfn2的定位是否可以影响抗病毒应答现在还不清楚。

2.1.2 其他蛋白与抗病毒免疫应答 香叶酰香叶酰化是蛋白质翻译后的脂质修饰，其通过Rac1限制MAVS介导的天然抗病毒免疫应答。在香叶酰香叶酰基转移酶-I缺陷的小鼠模型中研究发现，位于内质网-线粒体接触部位上的小G蛋白超家族中的Rac1直 接与MAVS结合，限 制MAVS与E3连接酶Trim31的相互作用，抑制MAVS的激活；同时Rac1与MAVS连接促进caspase-8∕cFLIPL向MAVS的转运，从而降解泛素化的Ripk-1，终止MAVS介导的抗病毒应答［22］。CHATEL-CHAIX等［28］发现，当登革热病毒（dengue virus，DENV）感染时，DENV的非结构蛋白NS4B与内质网上的卷曲膜相连，可以拉长线粒体、破坏内质网-线粒体接触结构域，从而促进DENV复制以及减少RIG-1依赖的干扰素对病毒的免疫应答。

2.2 内质网-线粒体接触与抗DNA病毒免疫应答DNA病毒是一种以脱氧核糖核酸为遗传物质的病毒，广泛存在于人、脊椎动物和昆虫体内。DNA病毒感染细胞时，主要依赖胞质DNA的信号传感器环状GMP-AMP合酶（cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate（cGAMP）synthase，cGAS）诱导Ⅰ型干扰素对双链DNA及逆转录病毒产生应答［29］。cGAS活性位点的重排促进cGAMP的合成，随后与内质网驻留的接头蛋白STING结合并伴随有TBK1的聚集。TBK1磷酸化STING的C末端尾部（CTT）结构域，导致转录因子IRF3的磷酸化并易位于细胞核，介导IFN-β的转录，产生免疫应答［30］。早期研究表明，STING与MAVS和RIG-1存在相互作用关系［31］，但STING-MAVS的相互接触在抗病毒免疫应答中的作用并未被阐明。此外，当某些RNA病毒感染时，可以触发mtDNA释放到胞浆，mtDNA结合cGAS但其具体机制还不清楚［32］。

3 总结与展望

内质网与线粒体作为细胞中重要的细胞器参与多种代谢调节。随着显微技术的发展，人们发现内质网与线粒体之间存在着紧密的接触，并且这一接触调控着细胞的多种生命活动，包括：磷脂合成、Ca2+转运、炎症反应、内质网应激等。越来越多的蛋白质或蛋白质之间的相互作用被证明参与内质网-线粒体接触的调节，应用分子生物学手段增加或敲除这些蛋白的表达，内质网-线粒体之间的接触也相应改变。然而，多数研究仅仅停留在发现这些蛋白可以影响内质网-线粒体接触，但其在免疫应答中的特定作用仍有待阐明。

在抗病毒免疫应答领域，有关内质网-线粒体接触在抗双链RNA病毒免疫应答中作用的研究较多，而在抗DNA病毒免疫应答方面的研究相对较少。而DNA病毒广泛存在于人、脊椎动物、昆虫以及多种传代细胞系中，和人类生活密切相关。因此，研究内质网-线粒体接触对病毒信号传导以及病毒的复制与组装是十分必要的，不仅为深入理解病毒感染的机制提供理论和实验依据，也可以为临床中抗病毒治疗提供新的方向。