运用基因调控技术探析膜联蛋白A2 的病理作用

贾梦真黄岩杰杨晓青韩红艳张建江

(1.河南中医药大学第一临床医学院,郑州 450046； 2.河南中医药大学第一附属医院儿科,郑州 450099；3.河南中医药大学,郑州 450046； 4.郑州大学第一附属医院儿科,郑州 450052)

膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)分子量为36×103,含有三个不同的功能区域：N 端区域,C 端区域和核心区域[1]。 核心区域由四个重复的氨基酸序列组成,它们紧密堆积形成一个具有凹面和凸面的弯曲结构,凸面含有膜结合必需的钙和磷脂结合位点,N 端结构域位于核心结构的凹面,含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和p11(S100A10 的片段)结合位点,C 端区域包含F-肌动蛋白,肝素和纤溶酶原结合位点[1-2]。 ANXA2 广泛分布于各种真核细胞的细胞膜、细胞质和细胞核,参与膜转运及膜表面一系列与钙调蛋白相关的活动,包括增殖、分化、凋亡、迁移、膜修复和炎症反应等多种细胞进程[3]。人ANXA2 是最早实现克隆的ANX 家族成员之一,在人类疾病学方面研究最广泛[4]。 既往报道ANXA2 在多种肿瘤中过表达,参与癌症的发生发展,涉及多种机制,并与预后不良密切相关[5]。 我们先前研究显示ANXA2 在参与肾小球细胞性新月体形成的上皮细胞中高表达,在伴有新月体病变的紫癜性肾炎患儿尿中的浓度也明显增高,拓展了对ANXA2 病理作用的认识[6]。 本文通过综述运用基因调控技术敲低、敲除和过表达ANXA2 的相关研究,以期更全面地总结ANXA2 的病理作用及其相关作用机制,并精准探寻可能的临床诊疗靶点。

1 基因调控技术在研究ANXA2 功能中的应用

近年来,基因调控技术广泛应用于ANXA2 功能研究。 基因敲除或敲低的技术包括siRNA(smallinterfering RNA)技术、shRNA(short hairpin RNA)技术和成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats ( CRISPR )/CRISPR-associated ( Cas ) 9,CRISPR/Cas9)技术。 因ANXA2 在多种疾病中过表达,有关探究ANXA2 功能的细胞及动物实验多采用siRNA 干扰技术降低ANXA2 表达水平。 靶向ANXA2 的siRNA 进入细胞质后,通过RNA 诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)机制与ANXA2 mRNA 互补结合,从而引起目标mRNA 降解,实现细胞或生物体ANXA2 基因沉默[7-8]。 但siRNA 技术存在脱靶率问题,在基因敲除实验中不能完全敲除目标基因。 在细胞核内合成的shRNA 可由Drosha 酶处理后转运至细胞质,并经Dicer 酶将shRNA 加工成siRNA,shRNA 诱导的基因沉默较siRNA 更持久[7]。 通过将敲除ANXA2基因的胚胎干细胞注射至胚泡,并植入假孕小鼠的子宫中,经嵌合体杂交育种可产生稳定敲除ANXA2的小鼠[9]。 CRISPR/Cas9 系统是新兴的基因编辑技术,通过sgRNAs 序列特异性互补并切割靶DNA,导致基因部分序列缺失,精准实现基因敲除[10]。 但应用CRISPR/Cas9 基因编辑技术靶向ANXA2 的研究较少。 目前多采用构建靶向ANXA2 基因的DNA质粒转染细胞实现基因的过表达[11]。

2 敲低或敲除ANXA2

2.1 敲低ANXA2 可抑制细胞上皮-间充质转化及肿瘤细胞侵袭、迁移和增生

细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有上皮表型的细胞失去极性和粘附性等上皮特征,转化为具有间充质表型的细胞[12]。 目前,与ANXA2 相关的EMT 报道主要涉及肿瘤 增 殖、 侵 袭、 迁 移 方 面。 胰 腺 导 管 腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)是一种破坏性恶性疾病,ANXA2 属于PDA 相关抗原,细胞表面ANXA2 的表达随着PDA 的进展而增加。 Zheng等[13]通过建立小鼠PDA 模型证实了ANXA2 在细胞表面的定位依赖于酪氨酸23(Tyr-23)位点磷酸化,并可通过Rho 介导PDA 细胞中转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)诱导EMT。敲低ANXA2 或使用抗ANXA2 抗体可有效抑制PDA转移并提高模型小鼠存活率,为开发靶向ANXA2抑制剂治疗人PDA 提供了理论依据[13]。 在鼻咽癌中,Chen 等[14]通过将靶向ANXA2 的shRNA 导入TW01 和BM1 鼻咽癌细胞系,建立特异性敲低ANXA2 细胞系,发现敲低ANXA2 可抑制TGF-β 诱导的Snail/Twist 癌症相关转录因子的表达,抑制鼻咽癌细胞EMT 进程,从而减少细胞侵袭、迁移,同时可提高放射治疗和化学治疗敏感性。 2018 年,Rocha 等[15]基于对敲低ANXA2 的结肠直肠癌细胞研究,提出TGF-β 可通过其受体激活Src 介导ANXA2 磷酸化,磷酸化的ANXA2 一方面促进E-钙粘蛋白内化,下调E-钙粘蛋白转录,另一方面结合并激活STAT3,同时诱导STAT3 磷酸化,磷酸化的STAT3 从细胞质转移至细胞核,上调EMT 相关转录因子Slug 的表达,进而上调波形蛋白和金属蛋白酶MMP2/9 的表达[16]。

ANXA2 可在细胞膜、细胞质等不同的细胞结构部位介导表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)功能。 细胞质中的ANXA2 在蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Src 激酶介导下实现N 端丝氨酸25(ser-25)和Tyr-23 位点磷酸化后,经钙离子载体或钙诱导剂移至细胞表面[17]。2019 年,Fan 等[18]研究表明,活化的蛋白激酶C 受体1(RACK1)是ANXA2 和Src 激酶的共受体,可介导两者结合,促进ANXA2 磷酸化。 EGFR 由细胞外配体结合结构域和胞质C 端酪氨酸激酶结构域组成,Chaudhary 等[19]发现在三阴性和赫赛汀耐药的乳腺癌细胞中,大量易位至细胞膜表面的ANXA2与EGFR 的细胞外结构域结合,在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)诱导下导致EGFR 同源二聚化和酪氨酸激酶区域自磷酸化后脱离细胞膜内化进入细胞质。 内化过程依赖于脂质筏对EGFR 的内吞作用,而ANXA2 作为Ca2+依赖性膜结合蛋白,在富含胆固醇和/或磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯域中与肌动蛋白细胞骨架相互作用,可调节脂质筏形成[20]。 研究者利用抗ANXA2 抗体阻断细胞表面ANXA2 功能可抑制EGF 诱导的EGFR 同源二聚化、酪氨酸磷酸化、内化和EGFR 介导的下游AKT和ERK 信号通路,从而抑制三阴性和赫赛汀耐药乳腺癌细胞的细胞增殖和迁移[19]。 Wang 等[21]提出磷酸化的EGFR 可引起细胞质ANXA2 Tyr-23 位点磷酸化,触发STAT3 途径。 使用shRNA 在表达EGFR 的上皮样乳腺癌细胞系T47D 细胞中稳定敲低ANXA2,可抑制ANXA2 介导的STAT3 Tyr-705 磷酸化,降低STAT3 活化和核转位,阻断EMT 的发生发展,表明ANXA2 可通过STAT3 依赖性方式促进EGF 诱导的乳腺癌细胞EMT。 在宫颈癌细胞中,敲低ANXA2 可部分逆转EGF 诱导的CaSki 宫颈癌细胞EMT 进程,并抑制CaSki 细胞活力和迁移[22]。 上述结果表明ANXA2 在EMT 进程中发挥重要作用,可能成为潜在的治疗靶点。 同时也证明了ANXA2可在EGFR 信号通路的上游和下游发挥不同的作用,在EGF 诱导的EMT 信号通路中具有上通下联的关键功能。

2.2 敲低ANXA2 抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，恢复顺铂耐药细胞的药物敏感性

ANXA2 作为引物识别蛋白参与DNA 复制[2],并通过不同的途径参与细胞周期进程。 Wang 等[23]发现经皮下注射ANXA2 缺陷型人肺腺癌A549 细胞(shANXA2-A549)悬浮液的BALB/c 裸鼠的背侧肿瘤结节明显小于对照组,用siRNA 敲低体外培养的A549 细胞的ANXA2,同样细胞增殖明显受到抑制。 进一步证明敲低ANXA2 可抑制JNK/c-Jun 通路,并诱导p53 及其下游凋亡基因如p21 表达,引起细胞周期G2 期停滞,从而抑制细胞增殖[23]。 Zhang等[24]用shANXA2 慢病毒转染人乳腺癌细胞系T47D 和MDA-MB-231,获得稳定敲低ANXA2 的细胞,发现敲低ANXA2 抑制EGF 诱导的STAT3 磷酸化,进而降低细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)水平。ANXA2 也是一种RNA 结合蛋白,可与原癌基因cmyc mRNA 的3′UTR 结合,从而导致其核周定位及与细胞骨架结合,并促进c-myc 蛋白的合成[5]。 Cmyc 在促进细胞增殖和凋亡中发挥重要作用,Cyclin D1 是c-myc 的下游因子,也是细胞增殖的关键促进因子,可延迟细胞G1 到S 期转变,抑制癌细胞增殖[5]。

顺铂是非小细胞肺癌患者的常用药,主要通过与相关DNA 上的嘌呤相互作用,激活数个信号转导途径造成DNA 损伤和线粒体凋亡并最终导致细胞凋亡,然而治疗过程中伴随的细胞凋亡作用减弱可能是肿瘤细胞获得顺铂耐药性的关键特征[25-26]。Feng 等[27]通过体内外细胞实验证明,非小细胞肺癌细胞的顺铂耐药性与ANXA2 调控的JNK/c-Jun/p53 途径中p21 等凋亡基因的异常表达密切相关,敲低ANXA2 增加了凋亡细胞数量,可部分恢复已耐药细胞的药物敏感性。 ANXA2 也可作为凋亡细胞表面C1q 的配体诱导自身裂解,抑制细胞周期促进凋亡[27]。 因此,ANXA2 基因可能用作耐药性非小细胞肺癌的重要治疗靶标。

2.3 敲低ANXA2 降低博来霉素诱导的肺纤维化

博来霉素是一种临床应用广泛的抗癌药物,然而其诱导肺纤维化的发生率高达46%,严重限制了博来霉素的临床使用和治疗效果。 博来霉素诱导的肺毒性涉及氧化应激和其引起的DNA 损伤,从而引起炎症反应。 2018 年一项研究发现,生理状态下ANXA2 可通过肌动蛋白促进噬菌体装配参与自噬过程[28]。 在小鼠肺部感染模型中,ANXA2 可通过肺泡巨噬细胞中的AKT-雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)途径调节自噬[29]。 2018 年,Wang 等[28]利用CRISPR-Cas9 基因编辑技术和蛋白质组学方法证明了在A549 细胞中ANXA2 的Glu139位点可直接与博莱霉素二糖片段的酰胺基结合,二者的结合可抑制TFEB(转录因子EB)诱导的自噬通量,进而导致肺纤维化。 2019 年Lei 等[30]证明博来霉素可诱导肺上皮细胞中ANXA2 向细胞表面易位,并激活整合素连接激酶/核因子-κB(ILK/NFκB)途径介导炎症反应。 同时将博来霉素经气管注射至缺失ANXA2 小鼠中14 d 后,通过Masson 染色和羟脯氨酸(胶原蛋白的标志物)定量分析证明,低表达ANXA2 小鼠肺间质厚度及胸膜下胶原沉积明显小于对照组,NF-κB 磷酸化以及p65、IL-6 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子表达水平降低[30]。 因此,ANXA2 可通过与博来霉素结合抑制自噬,促进炎症反应诱导肺纤维化,下调ANXA2 的表达可能是降低博来霉素所致肺部毒副作用的有效方案。

2.4 敲低ANXA2 抑制炎症

TNF-α 是TNF 超家族成员,介导一系列免疫反应,在炎症性肠病的发展中起关键作用。 去整合素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinases,ADAM)17 是裂解TNF-α 前体的关键酶,参与多种炎症性疾病的发生发展[31]。 为了明确ANXA2 是否参与TNF-α 裂解脱落,Tsukamoto 等[32]在单核细胞和结肠上皮细胞系中运用siRNA 分别敲低ANXA2或ADAM,均显著地抑制了细胞中TNF-α 的裂解脱落。 Tsukamoto 等[32]又运用免疫沉淀蛋白印迹法证实ANXA2 可直接结合并激活ADAM17,被激活的ADAM17 裂解TNF-α 的前体,使TNF-α 的释放增加,从而加重炎症反应。 因此,抑制ANXA2 可能是减少TNF-α 脱落,防治炎症性肠病炎症的新治疗策略。

2.5 敲低ANXA2 减少细胞表面的低密度脂蛋白受体水平，增加高胆固醇血症发生率

文献显示,前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9 型(proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9,PCSK9)的催化结构域可与低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的EGF-A 结构域结合,在酸性条件下经由内体/溶酶体能有效诱导肝LDLR 降解,较低水平的肝LDLR 降低了血浆中低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 的清除率,导致高胆固醇血症[33-34]。 ANXA2 基因位于染色体15q22.2 上,由13 个外显子组成,ANXA2 的R1 结构域由外显子4e6 编码,外显子4e6 具有8 个报告的单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism, SNP ),rs11633032 和rs17191344 为SNP 的功能性突变体,与LDL-C 水平正相关,其次要等位基因可产生转录因子阻遏蛋白结合位点,抑制ANXA2 基因表达[35]。ANXA2 通过其R1 域与PCSK9 富含半胱氨酸-组氨酸的结构域结合发挥PCSK9 功能的内源性抑制剂作用,ANXA2 单体和四聚体均可抑制PCSK9 对细胞表面LDLR 的降解活性,降低高胆固醇血症发生率[35]。 Ly 等[34]发现用shANXA2 转染人肝细胞癌细胞系Huh7 敲低ANXA2 细胞,可减轻ANXA2 对PCSK9 C 末端结构域M1 和/或M2 的抑制作用,使PCSK9 mRNA 在该细胞中翻译增加,加速对LDLR降解,升高循环LDL-C 水平,证实敲低ANXA2 解除了对PCSK9 活性的抑制作用,提高了高胆固醇血症风险。

3 过表达ANXA2

3.1 过表达ANXA2 加速纤溶酶产生导致肿瘤新血管生成及出血性疾病

p11 是钙结合蛋白S100A10 的片段,在细胞内钙浓度变化的驱动下,两个p11 的C 末端结构域可与两个ANXA2 单体的N 末端氨基酸结合形成异源四聚体[36]。 锚定于内皮细胞膜表面的ANXA2 四聚体是纤溶酶原和tPA 的共同受体,当ANXA2 过表达时可加速纤溶酶产生,并激活多种MMP(如MMP2,MMP9)参与下游蛋白水解级联反应,促进细胞外基质、基底膜溶解,释放内皮细胞以及基质中的血管生成调节剂(如血管内皮生长因子),启动血管生成系统[5,37]。 胶质母细胞瘤是最常见和致命的脑肿瘤,Maruo 等[38]将犬神经胶质瘤细胞系J3T 经皮下植入无胸腺小鼠中,6 周后分别在肿瘤中收集到J3T-1 和J3T-2 细胞系,经检测J3T-1 细胞系中ANXA2 表达水平高于J3T-2 细胞系,并且J3T-1 细胞主要聚集在肿瘤边界处的扩张血管周围,而J3T-2细胞则表现出弥散的单细胞浸润到周围正常的脑实质中,没有新血管生成。 Onishi 等[39]用ANXA2 编码质粒载体(pIRES-EGFP)转染J3T-2 细胞建立过表达ANXA2 的J3T-2 细胞系,并将其接种在无胸腺大鼠中28 d 出现脑肿瘤,在肿瘤中心观察到新血管生成而致血管扩张,同时血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高。 2020 年一项最新的研究表明,在三阴性乳腺癌细胞中外泌体ANXA2 也可促进新血管生成[40]。 总之,以上结果表明过表达ANXA2 可通过促进血管生成因子表达诱导血管生成。

ANXA2 过表达时,纤溶酶合成量过高可致周围组织受损,甚至引发出血,其中以急性早幼粒细胞白血病最具代表性。 其细胞具有特征性染色体易位t(15； 17),也称为早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α(PML/RARα)融合基因[41]。 PML/RARα 融合蛋白激活ANXA2 启动子上调ANXA2 mRNA,过表达的ANXA2 可通过翻译后调控导致p11 表达的增加,加速合成的ANXA2 四聚体促进纤溶酶以异常高的速率产生,大量活性纤溶酶在血浆中累积,最终导致急性早幼粒细胞白血病出血性并发症[41]。然而,He 等[42]提出纤溶酶可特异性激活Toll 样受体4 信号途径诱导PKC 活化,启动ANXA2 的ser-11 和ser-25 位点磷酸化,使四聚体解离,游离的p11 受到蛋白酶体依赖性多泛素化和降解,可阻止ANXA2 向细胞表面转移,从而保持ANXA2 单体和四聚体的精确划分。 纤溶酶的这种“反馈”机制可以限制自身的生成,从而维持血管纤溶系统平衡。

3.2 过表达ANXA2 促进上皮细胞增殖

据报道G 蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)可感知氨基酸的刺激,也可激活PKC 和蛋白激酶A(PKA),同时两个蛋白激酶参与介导ANXA2 磷酸化,而激素是刺激牛乳合成和牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)增殖的最重要因素[43]。 因此,激素刺激下ANXA2 与乳蛋白合成和BMEC 增殖密切相关。Osorio 等[44]认为氨基酸如甲硫氨酸可诱导mTOR途径相关蛋白磷酸化,对牛乳蛋白合成有积极作用。 2018 年, Zhang 等[43]为 了 研 究ANXA2 与BMEC 增殖和牛乳合成的分子机制,利用pcDNA3.1-ANXA2 构建体转染BMEC 过表达ANXA2。 结果显示,在氨基酸及雌激素刺激下,BMEC 中过表达的ANXA2 正向调节磷脂酰肌醇 3 - 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)产生PIP3,进而刺激mTOR 磷酸化,并增加固醇调节元件结合蛋白1c ( sterol response element-binding protein-1c,SREBP-1c) 和Cyclin D1 表达水平,经由PI3KmTOR-SREBP-1c/Cyclin D1 信号通路促进BMEC 增殖,合成乳蛋白、脂肪和乳糖等乳汁原料,加速乳汁合成[43]。 正如前所述,ANXA2 可能通过影响细胞周期因子促进增殖过程。

3.3 过表达ANXA2 参与多种病毒生命周期

文献显示,ANXA2 单体和四聚体可通过病毒-膜融合的内吞机制参与人乳头瘤病毒、肠道病毒71、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒的附着和渗入细胞内,参与多种靶向上皮细胞的病毒装配、复制和释放等过程,也是促进体外流感病毒复制的前病毒宿主因子,在加速高致病性禽流感病毒H5N1 的复制中起着重要作用[45-46]。 2019 年一篇文献显示,非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)是一种多功能蛋白,包含两个不同的功能域：N 端RNA 结合域和C 末端效应域,效应域与宿主蛋白相互作用,抑制宿主免疫反应,调节病毒感染过程[47]。 为了研究ANXA2 与NS1 在禽流感病毒H5N1 复制中的具体作用机制,Ma 等[46]利用RT-PCR 扩增A549 细胞的ANXA2 基因,然后将其克隆到pCAGGS-HA 载体中,构建重组质粒pCAGGS-HA-ANXA2,再用质粒及GD1322(H5N1 菌株)转染A549 细胞24 h,检测到子代病毒滴度显著增加。 免疫共沉淀实验表明ANXA2 可作为NS1 的靶分子,并与NS1 C 末端效应域相互作用,加速病毒复制。 细胞凋亡是抵抗病毒感染的宿主防御机制,NS1 与p53 结合可抑制细胞凋亡,基于ANXA2 和NS1 之间的相互作用以及p53的潜在拮抗作用,NS1 可能作为桥接分子促进ANXA2 和p53 结合以抑制细胞凋亡[46]。

4 总结

ANXA2 可作用于EMT 进程的不同位点,在EGFR 介导的EMT 信号通路中具有上通下联的作用。 ANXA2 具有博来霉素的结合靶点,两者的结合可抑制自噬通量,进而导致肺纤维化。 作为支架蛋白,Tyr-23 位点磷酸化是ANXA2 由细胞质向细胞表面移位的关键环节,ANXA2 四聚体可促进纤溶酶生成,裂解细胞外基质、基底膜,释放血管生成调节剂促进新血管生成。 此外,ANXA2 还可调节细胞增生、炎症和胆固醇代谢,参与病毒生命周期复制、凋亡等过程。 综上所述,运用基因调控技术精准揭示了ANXA2 的病理作用,拓展了对ANXA2 作用机制的认识,有助于探索针对ANXA2 的肿瘤早期诊断和靶向治疗,也有助于建立其他非肿瘤疾病的治疗策略。