腹泻型肠易激综合征中医病证结合动物模型研究❋

杨清瑞， 胡泽玉， 杜晓泉， 周 铖， 刘海涛

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种以肠功能紊乱为主的临床综合征，主要特征为腹部疼痛不适反复发作，常伴随粪便性状和排便习惯的改变[1]。建立有效且拟合临床度高的肠易激综合征中医证候动物模型，可以为本病的中医药治疗及相关科研提供重要帮助。目前IBS动物模型的相关研究尚处于探索阶段,造模方法尚不成熟,缺乏统一公认的复制方法。动物模型能否充分反映IBS的疾病特性，决定了研究结果的准确性及合理性。因此，为探究腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)中医病证结合动物模型复制方法，遂整理分析现有中医证候模型复制方法的文献，将切实可行的复制方法详述，以期在IBS-D中医证候动物模型的选择方面为本领域研究者提供有效参考。

1 动物模型造模思路概述

目前，肠易激综合征的病因及发病机制尚不清楚。最新的共识指南认为，主要与内脏高敏感、肠-脑互动异常、肠道动力异常、胃肠道激素、肠道感染、肠道微生物、精神心理障碍以及遗传和饮食等多种因素相关[2]。在临床根据排便特点和粪便形状，可将IBS分为腹泻型、便秘型、混合型、未定型[3]。根据IBS的主要症状，其属于中医学“腹痛”“泄泻”“便秘”等范畴。同时，根据《肠易激综合征中医诊疗专家共识意见(2017)》[4]，将IBS-D分为肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、寒热错杂证、脾虚湿盛证、脾胃湿热证5种证型。近年来，诸多学者为IBS病证结合动物模型的构建和评价奠定了大量理论与实践基础,促进了IBS病证结合动物模型的发展。目前，已有的肠易激综合征腹泻型中医病证结合动物模型的复制方法有肝郁脾虚型、脾胃湿热型、脾胃虚寒型、脾肾阳虚型，其构建方法主要是在现代医学疾病动物模型的基础上，结合情志与证候多因素制备而成，即分别复制出IBS动物模型和中医证候动物模型，叠加之后形成“病证结合”的肠易激综合征中医证候动物模型。

2 IBS-D模型常用复制方法及评价指标

2.1 IBS-D模型常用复制方法

常用的IBS腹泻型动物模型构建方法有早期生活应激、直结肠球囊扩张、化学药物刺激、病原体感染、复合方法及其他方法等，现将几种常用的IBS模型复制方法介绍如下。

2.1.1 束缚应激(wrap restraint stress,WRS) 使用包裹局部约束压力(WRS)程序诱发压力。先用异氟烷麻醉大鼠，然后用胶带束缚大鼠的前上肢和胸部2 h，每天1次[5]。

2.1.2 直结肠球囊扩张(colorectal distension,CRD) 对出生第8天的乳鼠进行直结肠球囊扩张刺激,向血管成形术的球囊(2 cm×0.3 cm)中注入0.3 mL的水，施加等同于60 mmHg的压力刺激1 min,每天2次(相隔30 min),共刺激2周[6]。

2.1.3 旋毛虫感染(Trichinization) 将含有旋毛虫感染的大鼠肌肉切碎后置于37 ℃的消化液(含有1%胃蛋白酶A和1%HCl)中16 h。经筛过滤、分离的感染幼虫用0.85%NaCl洗涤几次后，给予造模组大鼠0.2 mL悬液(含有8000个幼虫)灌胃[7]。

2.1.4 乙酸灌肠 给予大鼠乙醚轻微麻醉(吸入30 s)后，在肛内8 cm处滴注1 mL4%乙酸30 s，然后再滴入1 mL磷酸盐缓冲盐水稀释乙酸并冲洗结肠[8]。

2.1.5 母婴分离(maternal separation,MS) 将出生第2～14天的幼鼠与母鼠分离，放入盒中(规格5 cm×15 cm，温度32.0 ℃±0.5 ℃)独处3 h,结束后放回母鼠笼中,每日1次，连续造模14 d[9]。

2.1.6 急慢性应激法 给予大鼠以下刺激：水平振动(120次/min)40 min；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃环境3 min；45 ℃环境5 min；夜间连续照明12 h；夹尾1 min。随机给予模型组上述刺激,且连续2 d给予刺激顺序不能相同,连续3周。同时给予纸带束缚前肩、前上肢和胸部,限制前上肢搔抓头面部,但不限制其活动,束缚1h[10]。

2.2 IBS模型评价指标

IBS模型的观测评价指标主要包括腹部撤回反射和胃肠动力的测定，具体评分标准如下。

2.2.1 腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR) 在直结肠球囊扩张(CRD)下进行评估。评分标准参考文献[11]：对CRD无反应计0分；身体保持静止或头部轻微移动计1分；腹肌收缩计2分；壁从底部抬起并明显收缩计3分；身体拱起以及骨盆和阴囊的抬高计4分，进行相同的压力刺激3次，将平均分数作为最终分数。

2.2.2 胃肠动力的测定 在禁食不禁水24 h后,按照10 mL/kg的剂量给予大鼠活性碳墨水灌胃。30 min后用颈脱位法处死大鼠，立即取出整个小肠,剪切过程中不能拉伸。浸入5%福尔马林液以终止蠕动,然后测量活性碳墨水行进的距离以及小肠的总长度。用活性碳墨水染黑肠管长度/总肠管长度的比例(%)以评估胃肠动力[12]。

3 IBS-D中医证候动物模型复制方法及模型评价

3.1 肝郁脾虚型IBS-D动物模型复制方法

3.1.1 母子分离+慢性束缚+番泻叶灌胃法 张北华[13]和赵迎盼等[14]通过动物实验对3种造模方法进行了比较，最终研究表明，母子分离8周+慢性束缚应激3周+番泻叶灌胃1周为最佳的肝郁脾虚证IBS-D大鼠模型，并分为以下3步：(1)幼鼠出生后第2～14天，每天母子分离3 h后放回母鼠笼中。到第22天断奶，第30天随机分笼饲养，至8周后体质量超过250 g者进入下一步造模；(2)从第9周开始，每天在自制束缚架上黏贴软带束缚大鼠胸部和腹部3 h，连续3周；(3)束缚应激的同时，每天给予番泻叶水煎剂(浓度0.45 g生药/mL，剂量4.5 g/kg)灌胃，每日1次，持续1周。

3.1.2 番泻叶灌胃+慢性不可预知轻度应激法 罗丹妮等[15]采用番泻叶浸剂灌胃结合慢性不可预知轻度应激(hronic unpredictable mild stress,CUMS)造模方式：(1)给予番泻叶浸剂(浓度0.3 g/mL，剂量10 mL/kg)灌胃；(2)灌胃1 h后随机(抓阄分配法)进行多种慢性不可预见性刺激，包括束缚(固定于木制大鼠束缚固定器上2 h)、夹尾20 min、摇摆-拥挤(1 min内220次,时长1 h，每笼6只)、45 ℃温水游泳(5～10 min,当大鼠无力游动时立即捞出)、足底电击(电流1.5 mA,15 min内3次,每次30 s)、拥挤饲养24 h(6只大鼠)、孤养24 h，连续造模14 d。

3.1.3 饥饱失常+番泻叶灌胃+游泳实验法 郭红[16]采用这种方法在禁食12 h(不禁水)后给予大鼠灌胃番泻叶颗粒剂(浓度0.4 g/kg，剂量1 mL/100 g)；在灌胃1 h后强迫游泳(水温22 ℃～25 ℃,水深70 cm)，直到大鼠无力游动(头部沉入水中超过10 s)才捞出，连续造模14 d。

3.1.4 番泻叶灌胃+束缚应激法 郭军雄[17]采用以下方法：各组造模大鼠在实验前10 h禁食不禁水，按照4 g/kg剂量分别给予番泻叶煎剂灌胃，每天1次，连续灌胃7、14、21 d。采用透明宽胶带束缚大鼠的前肢、胸部和腹部，限制其搔抓头面部(但不限制其活动)，束缚1 h,每天1次，分别束缚7、14、21 d。

3.2 脾胃湿热型IBS-D动物模型复制方法

3.2.1 慢性不可预知轻度应激+高糖高脂饲料喂养法 文献[18-20]采用以下方法：(1)先将大鼠放入高温高湿环境造模箱(温度(32±2) ℃,相对湿度90%～95%)中，给予高糖高脂饲料喂养7 d；第15天时给予白酒(酒精度56%，剂量10 mL/kg)灌胃，每天1次，共7 d。与此同时随机进行多种慢性不可预见性刺激，包括夜间连续照明12 h，水平振荡(160次/min)45 min，禁食禁水24 h，(2)45 ℃环境5 min，夹尾1 min，4 ℃冰水游泳3 min。每日随机给予模型组上述刺激,并每连续2 d给予刺激且顺序不能相同,持续造模21 d。

3.3 脾胃虚寒型IBS-D动物模型复制方法

3.3.1 番泻叶灌胃+束缚应激法 文献[21，22]采用以下方法：(1)禁食不禁水10 h后给予大鼠番泻叶水煎剂(浓度0.3 g生药/mL，剂量20 mL/kg)灌胃，每天1次，连续14 d；(2)灌胃结束后用绳束缚住大鼠的后下肢1 h,每天1次，连续14 d。

3.4 脾肾阳虚型IBS-D动物模型复制方法

3.4.1 番泻叶灌胃+物理化学刺激法 文献[23-26]采用以下方法共分为4步:(1)冰醋酸灌肠。用石蜡润滑后的导管插入大鼠肛门内3～5 cm处，注入0.5%冰醋酸(首剂0.2 mL，每天增加0.1 mL，至0.5 mL时保持不变)，然后倒置大鼠1 min以防漏出，每天1次，连续14 d；(2)直肠扩张。将涂抹石蜡油的儿童型导尿管球囊塞入肛门内2～3 cm处，用5 mL注射器向球囊内充气(每天2次，每次充气1.5～2.0 mL，间断持续3～5 min)，连续14 d；(3)夹尾刺激。间断持续3～5 min，每天2次，持续2周；(4)叠加脾肾阳虚证模型，给予番泻叶浓缩剂(浓度0.3～0.5 g/mL，剂量20 mL/kg)灌胃，每天1次，持续4周。

3.4.2 番泻叶灌胃+避水应激法 侯理伟[27]和朱佳杰[28]采用以下这种方法：给予番泻叶浓缩剂(浓度1 g/mL，剂量10 mL/kg)灌胃，每天1次，持续28 d。4周后给予避水应激，取一个玻璃水槽(60 cm×30 cm×40 cm),中央有个小平台(10 cm×10 cm×10 cm)，水槽内注水9 cm,每天将大鼠置于平台上2 h，连续10 d。

3.4.3 番泻叶灌胃+直肠扩张法 韩博宇[29]通过对3种造模方法进行动物实验对比，结果表明高剂量番泻叶灌胃6周+直肠扩张法为最佳的脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型。给予大鼠番泻叶浓缩剂(浓度1 g/mL，剂量5 g/kg)灌胃，每天1次，连续6周。将涂抹石蜡油的自制球囊插入距肛缘约7 cm处，然后将大鼠置于自制小笼中使其不得转头,给予直结肠球囊扩张(压力80 mmHg，每天2次，每次间断持续5 min)，连续14 d。

3.4.4 番泻叶灌胃+束缚应激法 谭玮璐[30]和武志娟等[31]采用以下方法：(1)禁食24 h(不禁水)后给予大鼠番泻叶溶液(浓度200%，剂量20 mL/kg)灌胃，每天2次，连续14 d；(2)灌胃1 h后，用透明胶带束缚大鼠的前肢、肩部和胸部1 h，限制其搔抓头面部(但不限制其他活动)，每天1次，连续14 d。

3.5 IBS-D中医证候模型评价

IBS-D中医证候模型的宏观评价指标，主要记录大鼠每天的精神状态、活动情况、进食、皮毛色泽、口唇黏膜、体质量变化、粪便性状等一般状态。

3.5.1 肝郁脾虚证 各模型组大鼠神态倦怠易激惹，防御性强，毛发干枯散乱无光泽，消瘦，食欲减退，活动减少，反应迟缓，扎堆或蛰伏在角落，多数弓背静卧少动，眼角有分泌物，大便变软或不成形，肛门部有粪便污物附着等，类似中医肝郁脾虚表现[13-15,17]。

3.5.2 脾胃虚寒证 造模后大鼠初期表现为极度烦躁,尖叫易怒，后来开始腹泻、毛发无光泽、消瘦、活动减少、精神萎靡，类似中医脾胃虚寒表现[22]。

3.5.3 脾胃湿热证 造模后IBS模型组大鼠易激惹，糖水摄取量明显减少，大鼠精神倦怠，萎靡不振，反应迟钝，嗜卧，活动减少，大便稀或溏泄,肛周污秽，皮毛枯槁无光泽,竖毛，饮食量下降，体质量增长缓慢，类似中医脾胃湿热表现[19]。

3.5.4 脾肾阳虚证 造模后大鼠的活动开始减少，精神倦怠；随着时间延长，出现萎靡不振，蜷卧贴笼，拱背，扎堆，大鼠洗脸、舔足、理毛的动作减少，皮毛发黄少光泽，胡须下垂，活动量少，反应迟缓，体质量下降，饮水增多，进食减少，排便次数增多，肛周粪便污物附着[23,27，28]。

4 讨论

腹泻型肠易激综合征中医病证结合动物模型是西医辨病和中医辨证相结合的复合模型，其本质是模拟临床中西医结合模型，是目前较为符合临床的一种中医证候动物模型复制方法。当前IBS中医病证结合动物模型复制方法主要分2种，一是先构建IBS模型,在此基础上再复制中医证型模型；二是先复制中医证型，在此基础上再构建IBS模型。

虽然这些模型的复制方法同时兼顾IBS的西医病理表现和中医证候的病机特征，有利于研究疾病不同证型宏观与微观的具体生物学表现，为中医药治疗疾病提供客观化证据，但仍有一些地方有待商榷。如在IBS中医证候模型的复制过程中，不同的中医证型使用相同或相似的造模方法，容易造成脏腑兼证候的混淆。笔者所纳入的文献研究中，肝郁脾虚型[17]、脾胃虚寒型[21，22]和脾肾阳虚型[30，31]IBS动物模型的复制方法都有使用番泻叶灌胃联合束缚应激的复合造模法，虽然造模药物的用量及用法有所不同，慢性应激刺激的强度也不一样，但也很难判定复制的IBS动物模型中医证候的真实属性。在中医证候模型的评价指标中，仅以宏观体征和行为表现中包含的中医证候临床表现为判定依据，使得中医证候模型的评价标准不够客观和科学，不但影响了中医证候建模率和后续实验的进展，还降低了造模方法可复制性，实验结果难以得到其他学者的认可和推广。

鉴于此，有学者[32]提出从生物代谢的视角来认识中医药的现代内涵，通过代谢组学的研究方法获取人体内动态代谢变化的综合信息，从而提供中医证候的量化证据并阐明中医药的机理。

因此，后续开展的中医实验研究可以从多途径探索机体与内外环境之间的整体性规律，进而建立起病证结合动物模型客观、准确的评判标准和体系，并探索更加科学合理的中医证候与动物模型相结合的方法，为中医药治疗腹泻型肠易激综合征的实验研究提供更有效的工具。