大肠杆菌表达病毒样颗粒的研究进展①

李生军 张海霞 冯若飞 （西北民族大学生物医学研究中心，兰州730030）

自1796年预防天花的牛痘疫苗诞生以来，疫苗至今已有200 余年的发展历史，其研制与应用是上世纪公共卫生领域最伟大的成就之一［1］。疫苗是用于预防、控制传染病的发生和流行的一类生物制剂，同时也是遏制甚至是消灭传染病最有效的方法［2］。目前，传统技术生产的疫苗大多是减毒疫苗或灭活疫苗，但是这两种疫苗都可能存在毒力残余和恢复等安全问题［3］。在20世纪70年代，科学家发现病毒来源的关键蛋白可作为用来研制疫苗的抗原，伴随着现代生物学迅猛的发展，重组亚单位疫苗开始蓬勃发展［4-5］。

作为一种新型亚单位疫苗，病毒样颗粒（virus like-particles，VLPs）以它独特的优势及良好的安全性，成为一种应用前景广阔的疫苗替代物。VLPs由一种或多种结构蛋白组装而成，形态和结构与天然病毒相似，但不含病毒的遗传物质，据大量研究结果表明VLPs具有高免疫活性，并证实了触发B细胞活化和高滴度抗体的产生与VLPs 的结构和表面密集重复的氨基酸（AA）基序密切相关［6-7］。由于VLPs具有对称且高度重复的AA 结构，即使在没有常用佐剂的情况下，也能诱导较强的体液和细胞免疫反应［8］。

目前用于生产VLPs 的平台以杆状病毒和大肠杆菌表达系统为主，其中大肠杆菌作为VLPs表达的首选宿主菌，具有细胞生长快速、培养周期短、分子操作简易、表达量高和在低廉的培养基中快速繁殖等优势，这也使得VLPs 的表达易于规模化，成为VLPs 构建的首选表达系统［9-11］。本文将基于大肠杆菌表达VLPs及其组装、表位结构特征和临床试验结果等研究进展进行综述。

1 DNA病毒VLPs

1.1 单链DNA病毒VLPs研究进展

1.1.1 猪圆环病毒2 型VLPs 猪圆环病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）是一类无囊膜的单股环状DNA病毒，病毒粒子大小约为17 nm，呈二十面体对称，是迄今为止发现的最小的动物病毒之一［12］。2009 年我国引进了德国由杆状病毒生产的亚单位疫苗［13］。此外，国内首个由普莱柯生物工程股份有限公司采用大肠杆菌表达组装的VLPs 疫苗已于2017 年成功上市，为PCV2 疾病的防控带来了福音［14］。2018 年 LI 等［15］利用 FMDV 中和 B 细胞表位区代替PCV2-Cap 蛋白的第123～151 和第169～194 氨基酸，经大肠杆菌表达后在体外成功组装成VLPs，免疫实验结果表明，Capfb-VLPs 可诱导小鼠和豚鼠同时产生抗PCV2b 和抗FMDV 抗体反应，而不诱导抗诱骗表位抗体。2019 年 DING 等［16］以甲型流感病毒（IAV）M2e 蛋白连接至PCV Cap 蛋白C 末端，成功制备 Cap-M2e VLPs，该 VLPs 对 IAV 和 PCV的攻击有双重保护作用。2019 年 WANG 等［17］利用已知的 PCV2-Cap 晶体结构（PDB 登录号：3R0R）在85G-86S 之间插入 PPV B 细胞表位 B5-E1（228QQIT‑DA233），将该基因序列克隆到pET100 载体并表达，成功获得VLPs，并能诱导小鼠和豚鼠同时产生抗PCV和PPV抗体。

1.1.2 猪细小病毒VLPs 猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）为单股线状DNA 病毒，病毒粒子直径约为20～23 nm，无囊膜［18-19］。PPV 感染后主要引起母猪繁殖障碍性疾病，目前尚无有效的治疗方法，仍采用疫苗免疫进行预防控制。国外多使用弱毒疫苗，而我国普遍使用灭活疫苗［20］。JI 等［21］报道了一种PPV VP2 蛋白与伴侣分子共表达形成的VLPs，其大小、形状与天然病毒相似，用该VLPs 免疫小鼠和豚鼠，可诱导产生中和抗体和HI 抗体反应，并显著降低了病毒攻击后豚鼠脾脏中PPV 的含量。蒋春英等［22］在 PPV VP2 基因 5'端连接日本脑炎病毒（JEV）中编码B细胞和T细胞的表位序列，成功获得连接JEV 多表位肽的PPV VLPs。利用BALB/c 小鼠评价VLPs 的免疫原性，结果表明该VLPs 不但能够诱导机体产生PPV 特异性的中和抗体，且中和抗体水平与PPV 灭活疫苗产生的中和抗体水平没有显著差异。宋品等［23］选用PPV 结构蛋白 VP2，成功在体外组装 VLPs。陈玉梅等［24］针对PPV VP2 构建原核表达载体，在伴侣分子协同作用下，表达的VP2 蛋白成功在体外组装成VLPs，动物实验证实，VLPs可刺激小鼠产生高滴度的中和抗体。

1.1.3 犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）VLPs CPV为单股线性DNA病毒［25］。目前，CPV疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但是不能有效预防CPV多个分型的感染，基于此，NAN等［26］构建了CPV VP2原核表达载体，并在伴侣分子pTf16协同作用下，在体外组装得到CPV VLPs。免疫原性评价结果显示，该VLPs可使免疫后豚鼠产生高效价的HI抗体和中和抗体。XU等［27］构建了pSMK VP2并表达，成功获得组装的VLPs，免疫小鼠后可刺激机体产生良好的体液免疫和细胞免疫反应。

1.1.4 人细小病毒VLPs 人细小病毒（human par‑vovirus B19，HPV B19），简称B19 病毒，为单股线性DNA病毒，无囊膜。B19主要通过呼吸和母婴传播，且感染后的临床症状比较复杂［28］。SANDRA 等［29］采用原核表达系统成功在体外构建以VP2 蛋白为基础的VLPs，并对组装条件进行了优化，使其组装的VLPs 最接近病毒粒子的天然构象。ARELI 等［30］在B19 衣壳蛋白VP2 的第71～72 碱基之间插入人类呼吸道合胞病毒F 蛋白的第215～278 碱基，并定向克隆至pET22b中进行诱导表达，表达的重组蛋白分离纯化后在酸性条件下能体外自组装成VLPs。

1.2 双链DNA病毒VLPs研究进展

1.2.1 人类乳头瘤病毒VLPs 人类乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）为闭合环状双链DNA病毒，无包膜，有8 个开放阅读框，编码6 个早期蛋白和2个晚期蛋白（L1、L2），电镜下天然的病毒粒子呈二十面对称。该病毒与口腔癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌有着高度的相关性［31］。目前获批上市的疫苗有HPV16/18/6/11 四价苗Gardasil®和HPV16/18 二价苗 Cervarix®［32-33］。目前，针对 HPV VLPs 疫苗也有相关研究，谢明辉等［34］通过扩增HPV18 的L1 基因，并采用大肠杆菌表达，成功获得组装的VLPs。用该HPV VLPs 接种山羊和兔后，检测中和抗体，实验结果表明中和抗体滴度较高。魏旻希等［35］通过扩增 HPV16 L1 基因，并构建 pTO-T7-L1 重组载体，可成功诱导表达HPV16 L1 蛋白并在体外装配为直径 50 nm 的 VLPs。杨春燕等［36］根据GenBank 数据库AF335603.1序列合成HPV11-L1全长基因，构建表达载体pTO-T7-HPV11-L1，诱导表达的重组蛋白在体外成功组装成HPV11 VLPs 且组装效率达到100%，免疫小鼠后中和抗体滴度可达106。

1.2.2 乙肝病毒 根据疾病控制与预防中心（CDC）的数据显示，全球约有2.4 亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者，与感染的成人相比，新生儿中HBV 感染很难被清除，尤其是围生期感染的儿童，其中有90%会演变为慢性感染，现有的乙肝疫苗对于慢性感染并不奏效，并且HBV 感染后引起的免疫耐受是研制治疗性疫苗的最大障碍［37-39］。基于此，乙肝新型疫苗的研制迫在眉睫。WHITA‑CRE 等［40］将 HBV PreS1 特异性中和 B 细胞表位插入到能增强多价抗体产生的变异WHcAg上，成功表达PreS1-WHc-VLPs，研究结果表明，用PreS1-WHc-VLPs 免疫HBV-Tg 免疫耐受小鼠和野生型小鼠后，可诱导两种小鼠产生滴度水平相当的抗PreS1 特异性中和抗体；此外，将PreS1 特异性中和抗体注射到乙型肝炎小鼠中可预防急性感染，并能清除先前感染HBV 小鼠血清中的HBV；在T 细胞水平，PreS1-WHc-VLPs 刺激 HBcAg 特异性 CD4+/CD8+T 细胞，以清除细胞内的HBV并防止cccDNA的积累。

上述 DNA 病毒 VLPs 研究结果发现，在 VLPs 构建过程主要由病毒的一种或多种结构蛋白自组装成不含遗传物质的空心衣壳，因此病毒无法复制和增殖，同样不具备感染致病的能力。此外，衣壳蛋白作为抗原决定簇的重要组成部分，不仅可以刺激机体产生中和抗体，而且与病毒的复制等过程密切相关，如：研究发现PCV2 的Cap 蛋白与病毒的毒力以及复制有密切的关系［41］；CPV 的 VP2 蛋白与病毒的感染与复制有关［42］；B19 的 VP1 和 VP2 在病毒复制以及病毒DNA 入核等过程发挥着重要的作用［30］；HPV 衣壳蛋白L1 参与病毒的入侵以及包装过程等［43］。

2 RNA病毒VLPs研究进展

2.1 口蹄疫病毒VLPs 口蹄疫病毒（foot-andmouth disease virus，FMDV）属于无囊膜的正链RNA病毒，主要引起的偶蹄类动物的急性、热性、高度传染性疾病［44-45］。目前我国主要采用 O、A 与 Asia1 型口蹄疫三价高效灭活疫苗对口蹄疫进行防控，但是疫苗价格相对较高。近年来，FMDV 病毒样颗粒疫苗的研究取得了较大进展，GUO 等［45］通过改造载体构建了 pSMK-VP0、pSMA-VP1、pSMC-VP3 等三种质粒，并共转入大肠杆菌后成功表达VP0、VP1、VP3蛋白，这三种蛋白在体外可自装成与天然病毒颗粒样结构相似的VLPs，利用PD50测试评估VLPs 疫苗效价显示FMD VLPs 组疫苗效力可达每剂6.34 PD50。XIAO 等［46］以 FMDV Asia1 为模板，扩增含有核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）的RBS-VP0、RBS-VP1、RBS-VP3，并克隆至pET28b 诱导表达，表达产物在体外成功组装成VLPs，该VLPs 与佐剂乳化后接种实验牛，可持续6 个月产生FMDV 特异性抗体，疫苗效力可达到 11.75 PD50/剂。LEE 等［47］通过载体改造并分别构建了表达载体pHD-Amp-VP0VP3、pHD-Kan-VP1，两种质粒共同转化至BL21诱导表达，表达产物可成功在体外组装成FMDV VLPs。董虎等［48］以南非2型FMDV 为模板构建重组质粒pSMK-VP0VP3 和pSMK-VP0，并同时转入大肠杆菌 BL21 后成功诱导表达 VP0、VP1、VP3 蛋白，纯化后经电镜分析在体外成功组装成VLPs。

2.2 戊型肝炎病毒VLPs 戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）基因组为线性单股正链的RNA，长约7.2 kb，包含3 个开放读码框架，其中ORF2 主要编码结构蛋白。据不完全统计，全球有近三分之一的人口受到HEV 的威胁，防控该病最有效的方法就是免疫接种［49］。目前，有 2 个 HEV 疫苗已进入临床试验阶段，分别是rHEV 和p179疫苗，而全球唯一商品化的HEV 疫苗则是由厦门大学和厦门万泰沧海生物技术有限公司联合研制的HEV VLPs 疫苗，该疫苗利用大肠杆菌表达HEV 的ORF2 片段制备，并进行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期临床试验，已于2012年批准上市［50］。尽管如此，研究人员对HEV 的研究还在不断地深入，IM 和 GE 等［51-52］发现 HEV 结构蛋白中一个位于aa 394~aa 606 的多肽E2 能保护恒河猴免受HEV 病毒的感染。LI 等［53］将 E2 蛋白 N 端的 26 个氨基酸延伸至aa 368位置在大肠杆菌中表达重组蛋白p239，成功形成 VLPs，动物实验证实 p239 VLPs 具有良好的免疫原性和免疫保护性。

2.3 流感病毒VLPs 流感病毒是单股负链RNA病毒，该病毒由空气传播，且传播速度快，人感染后主要引起严重的呼吸系统疾病，死亡率约为30%［54］。流感病毒基因组由8 个节段组成，由于其RNA 聚合酶不具备纠错功能，所以病毒极易发生变异，以逃避机体免疫。有研究表明H3 亚型流感病毒HA 的高度保守长α 螺旋区域（LAH）的76~133 aa可以诱导小鼠产生中和抗体［55］。基于以上研究，ZHENG 等［56］分别从 Sh2/H7N9 HA 基因和乙肝病毒基因中扩增出LAH基因和HBc基因，并将LAH插入到HBc 基因片段中，在体外组装成30 nm 大小的VLPs，动物实验表明，制备的LAH-HBc-VLPs 疫苗与佐剂乳化后能使小鼠免受同源病毒（H7N9）和异源病毒（H1N1和H3N2）的攻击。

2.4 猪流行性腹泻病毒VLPs 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于单股正链 RNA 病毒［57］。针对 PEDV 重组疫苗的研究主要集中在纤突蛋白S上，有研究表明S蛋白上存在3个B 细胞表位，膜糖蛋白M 上也存在一个B 细胞表位［58］。2017 年 FRANK GILLAM 在 HBc 的 79～88 aa之间分别插入上述四个B 细胞表位，此外将4 个B细胞表位依照S1-S2-M 的顺序插入至HBc 相同的位置，经大肠杆菌诱导表达后的蛋白均能组装成直径为 30～40 nm 的 VLPs。用 VLPs 免疫 BALB/c 小鼠，结果显示，不管是单个表位VLPs免疫组还是多表位VLPs 免疫组，血清和粪便中的IgG 和IgA 随着免疫剂量的增高而增高。病毒中和抗体实验结果显示，只有S1表位的VLPs 和S1-S2-M 表位的VLPs 能够诱导机体产生中和抗体，且两者中和抗体滴度没有明显的差异［59］。

2.5 西尼罗河病毒VLPs 西尼河病毒（West Nile Virus，WNV）基因组为单股正链 RNA 病毒，基因组包括一个开放阅读框，编码核衣壳蛋白（C）、跨膜蛋白（PrM）和囊膜蛋白（E），该病毒主要引起马、鸟类和人类致死性脑炎［60］。SPOHN 等［61］通过扩增 WNV E 蛋白的结构域Ⅲ，并将目的基因克隆到表达载体pET42T，该重组质粒转化至大肠杆菌BL21，经诱导表达后可在体外自组装成WNV VLPs。WNV 攻毒实验结果表明，单次注射WNV VLPs 疫苗就足以在小鼠体内诱导产生大量的中和抗体，即使在没有任何佐剂的情况下，注射三次WNV VLPs 疫苗也完全可以保护小鼠免受致命的WNV攻击。

2.6 猪繁殖与呼吸综合征病毒VLPs 猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV）为单股正链 RNA 病毒，主要引起感染猪发热、母猪流产、早产、产死胎等［62］。MURTHY 等［63］以 HBV 为载体，在其核心抗原（HB‑cAg）的第78~79氨基酸之间插入PPRSV的B细胞和T细胞表位，并克隆至原核表达载体pET28a，诱导表达后的蛋白在体外自组装成HBcAg VLPs；实验结果表明，HBcAg VLPs 不仅能有效阻断PPRSV 对敏感细胞MARC 145 的感染，而且还能引起强烈的B 细胞和T细胞反应。曹佳媛等［64］同样以HBc为载体表达PRRSV 保护性抗原GP5，成功构建HBc-GP5 表位VLPs，利用小鼠进行免疫原性评价，结果显示，HBc-GP5 VLPs 能够有效提呈GP5 并诱导机体产生体液和细胞免疫。

2.7 轮状病毒VLPs 轮状病毒（rotavirus，RV）是引起0～5 岁儿童急性胃肠炎的主要病原，为双链RNA 病毒［65］。目前国内上市的 RV 疫苗主要是单价Rotarix 疫苗和五价Rotateq 疫苗。针对RV VLPs 的研究主要集中在杆状病毒表达系统，但常乐等［66］通过将RV 的NSP3 基因片段插入到原核表达质粒pA‑CYC-MS2 T7 启动子下游，构建的 pACYC-MS2-NSP3 表达载体可在大肠杆菌中成功表达含RV NSP3 基因的VLPs，温度稳定性研究结果表明，该VLPs 在不同温度下均能放置10 d 仍保持稳定，为VLPs疫苗在运送、保存等过程提供了质量保证。

2.8 其他RNA 病毒VLPs 近几年爆发的新型RNA 病毒严重急性呼吸综合征（severe acute respira‑tory syndrome，SARS）、中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）等给世界卫生安全带来了不可估量的损失，针对这些病毒的大肠杆菌表达VLPs疫苗的研究相对较少，但有在其他表达系统中研究的报道。

SARS 以高病死严重威胁着人类健康，VLPs 疫苗以其较好的安全性和良好的免疫原性成为该病毒最有潜力的候选疫苗。KHAN 等［67］用杆状病毒表达系统同时表达SARS 的M 蛋白、E 蛋白及3a 蛋白，在昆虫细胞内能组装成类似于SARS 病毒粒子的球形VLPs。LU 等［68］同样以杆状病毒表达系统同时表达M 蛋白、E 蛋白和S 蛋白，研究发现此种组装搭配不仅能提高VLPs的组装效率，而且能使其分泌型表达。LIU 等［69］将 SARS 的 S 蛋白和流感病毒 M1 蛋白利用杆状病毒表达系统同时表达，组装成嵌合型S/M1 VLPs，免疫小鼠后可诱导产生S蛋白特异的免疫应答。

中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respira‑tory syndrome coronavirus，MERS-CoV）于 2012 年首次分离，是一种病死率达35%以上致死性冠状病毒。目前尚无获批的MERS-CoV预防性疫苗。王翀等［70］将 MERS-CoV 纤突蛋白 S、膜蛋白 M 和包膜蛋白E 基因重组至杆状病毒表达载体，将共表达S、M和E基因重组杆状病毒感染Sf9细胞，培养后的细胞上清液经蔗糖梯度密度离心后，得到MERS-CoV VLPs，动物实验评价MERS-CoV VLPs的免疫原性较好，表明MERS-CoV 嵌合型VLPs具有开发成为其疫苗候选株的潜能。

上述 RNA 病毒 VLPs 研究结果表明，VLPs 不仅可以诱导有效而广泛的免疫应答，而且易于被树突状细胞识别，其抗原成分经加工处理后递呈MHCⅡ类分子，促使树突状细胞的成熟和迁移。此外，VLPs不仅可以通过交叉提呈的方式经MHC Ⅰ类分子递呈，活化CD8+T 细胞，实现由CD8+介导的保护性免疫应答，而且也可作为自身佐剂，即使没有免疫佐剂的情况下，VLPs也能诱导很强的体液和细胞免疫［71］。就目前VLPs 的研究进展来看，构建VLPs主要集中在无囊膜病毒中，包膜病毒VLPs由于其形状和结构极不规则，所以通常无法在实验中确切的模拟天然病毒结构。

3 问题与展望

迄今为止，不同表达系统来源的病毒样颗粒在各实验室成功制备，但只有极少数的能在疫苗应用中取得突破性进展，制备工艺、组装工艺等是限制病毒样颗粒疫苗发展的重要原因。虽然大肠杆菌表达系统由于具有低成本、安全性好、操作简单、高表达、生产周期短等优点而被广泛应用于生物医药领域，但在制备和组装结构复杂的病毒样颗粒方面仍然存在诸多问题。①许多病毒迫于免疫系统的压力发生抗原变异，因此VLPs不能针对变异抗原产生持久的免疫应答。②VLPs 在基础研究中的预防性疫苗主要针对单个血清型，不能起到预防其他血清型病毒攻击作用。③组装VLPs 的蛋白有时不止一种，因此组装成VLPs的概率很小。④由于大肠杆菌细胞质是偏还原性的环境，因此蛋白质容易形成错配的二硫键，导致异源蛋白形成包涵体［72］。⑤大肠杆菌来源的蛋白纯化时与其是否可溶密切相关，可溶性蛋白在纯化过程中不仅省去了繁琐的变性与复性，也减少了有效分子的损失，所以很多人开始从表达载体以及伴侣分子共表达系统着手，实现目标蛋白可溶性以及使纯化过程由繁至简。杆状病毒表达系统包装的VLPs虽然不存在变性与复性，但是VLPs 与杆状病毒芽生型病毒粒子类似，所以在后期使用密度梯度离心进行纯化时操作繁琐［73］。⑥内毒素的去除，由于生产过程中工艺条件的变化及抗生素的使用等，会使部分大肠杆菌死亡或分解，此时会释放一种脂多糖称为内毒素。由于机体对内毒素有免疫识别作用，因此大肠杆菌来源的生物制剂必须进行彻底纯化，去除产生的内毒素使其达到药品中规定的含量后方可使用［74］。目前报道去除内毒素方法主要有超滤法、活性炭吸附法、亲和吸附法、离子交换层析等。其中超滤法和活性炭吸附法由于对目标分子是非特异性选择，所以会导致有效分子流失［74-75］；活性炭吸附法在样品处理后活性炭不易除去，影响产品的后续使用；而亲和吸附法和离子交换层析对制剂中的内毒素有高度的特异性与选择性，相较而言，在目标蛋白损失最小的情况下，能更有效地去除制剂中的内毒素［76］；此外，有研究表明内毒素的重要组成部分脂质A 可刺激 TLR4/MD-2/CD14 以及 caspase-11 等通路，从而产生免疫炎症反应［77］。因此，LIU 等［78］通过基因工程的方法减少脂质A 的脂肪酸链并去除1'-磷酸基团，从而最大限度地降低内毒素毒性，表达具有低内毒素活性的蛋白质。尽管存在诸多不足，但是可以通过目的基因优化入手，同时进行大肠杆菌外源表达调控基因改造以及多种内毒素去除方法的结合等来解决以上问题。

总之，人工构建的VLPs 作为一种新兴的技术，在病毒的预防、治疗以及诊断方面具有广阔的前景，相信大肠杆菌表达系统和最接近免疫功能的病毒样颗粒相结合，会带给我们一个疫苗研发全新的开始。