温度和干旱胁迫下绳状青霉菌P1的溶磷能力研究

张建峰，王冠雄，黄 佳，姚宗沐，张洁婧

(吉林农业大学 生命科学学院,吉林 长春 130118)

磷是植物生长发育的必要元素之一[1],在植物生长过程中起着重要作用[2]。但是，植物对磷肥的利用效率仅为5%～25%[3]。磷肥的过量使用会导致土壤板结、植物根系生长受抑制、土壤中营养比例严重失调等不良结果。因此，提高磷肥使用效率对农业的可持续发展具有重要意义。溶磷微生物通过分泌有机酸或质子，降低土壤pH，将土壤中的难溶磷转化为可溶性磷。大量研究表明，溶磷微生物不仅能将难溶性磷转化为可溶性磷供植物利用，而且能分泌生长素促进植物生长[4-5]。Ahmad等[6]研究表明，溶磷菌株Q3和Q6使棉花幼苗芽长分别增加了71%和59%，根长增加了162%和136%，鲜质量分别增加了75%和87%。Ouahmane等[7]研究表明，溶磷菌株PH4使樟子松幼苗鲜质量增加了1.43倍。溶磷微生物数量约占土壤微生物总量的10%，其种类多样[8]，包括细菌[9-10]、真菌[11-12]、放线菌[13-14]。大多数溶磷微生物只有在适应的环境条件下才会正常溶磷[15]，恶劣的自然环境条件会严重影响其代谢，从而降低其溶磷能力。Hueso等[16]和叶德练等[17]研究表明，干旱胁迫会影响微生物呼吸，从而影响其活性。目前抗旱能力强的溶磷菌株比较少见。林凤莲等[18]研究发现，大部分溶磷菌株的溶磷量均随着干旱胁迫程度的加剧呈显著下降趋势，在重度干旱胁迫下,P6、P7和P25的溶磷量分别下降了74.96%，86.97%和44.43%。可见干旱胁迫会严重抑制溶磷菌的溶磷能力。土壤温度也是影响土壤微生物生长最主要的因素[19]，不同的微生物群落有着其特定的温度适应范围。我国北方地区极端最低气温为―42 ℃，极端最高气温可达36.1 ℃[20]，温度过低会使微生物减少或停止正常的代谢活动，而温度过高会破坏微生物呼吸酶导致微生物不能正常生长[21]。巩文峰等[22]研究表明，溶磷菌株PSB19在10 ℃的低温条件下生长良好。李鸣晓等[23]研究表明，在50 ℃下培养溶磷菌株P1～P5 7 d后，其溶磷量为30.9～47.6 mg/L。目前报道的温度适应性好、耐干旱的溶磷菌株较少，且多为细菌，尚未见溶磷真菌的相关报道，因此筛选一株抗旱能力强且温度适应性好的溶磷真菌具有重要意义。本课题组前期从吉林西部盐碱土壤中分离鉴定出一株绳状青霉菌P1，该菌在适宜温度下溶磷能力很强，可以达到1 120.52 mg/L(目前溶磷能力较强的微生物的溶磷量为900～1 100 mg/L)。为了探讨绳状青霉菌P1对植物生长的作用及干旱和温度胁迫对其溶磷能力的影响，本试验研究了其对绿豆种子萌发的影响及其在不同温度和模拟干旱胁迫下的生物量、溶磷量以及发酵液pH，以期为生物磷肥的研制提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：绳状青霉菌(Penicilliumfunicuiosum)P1，筛选自长春市农安县西的盐碱土壤，为吉林农业大学秸秆生物学与利用教育部重点实验室―80 ℃冰箱中保存菌种。绿豆种子为中绿一号，购买于湖北省宜昌市民源种子专营店。

种子培养基为PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH自然。NBRIP培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)27 g，蒸馏水1 L，pH 8。

1.2 P1对绿豆种子萌发的影响

绿豆种子用质量分数2%次氯酸钠溶液消毒1 min，然后用蒸馏水冲洗5次。P1在PDA培养基中28 ℃培养72 h，用无菌水制成孢子悬液(1×104CFU/mL)。将绿豆种子用沾蘸法沾P1菌悬液5 s，置于铺有2层湿滤纸的无菌培养皿中，保持水的高度在种子的1/2处，以无菌水处理种子做对照，每处理重复3次，在28 ℃培养箱中培养4 d，相对湿度为85%，记录绿豆种子的发芽率、根长、芽长、鲜质量、干质量、发芽势、发芽指数和活力指数。具体计算公式[24]为：发芽率(r)=N4/N×100%，其中N4为处理4 d内发芽的种子粒数，N为供试种子数；发芽势(p)=N3/N×100%，其中N3为处理3 d内发芽的种子粒数；发芽指数=∑(Gt/Dt)，其中Gt为每天发芽种子数，Dt为发芽时间。活力指数=第4天幼苗鲜质量×发芽指数。

1.3 干旱胁迫下P1的溶磷能力测定

种子悬液的制备:将保存的P1菌种在PDA固体培养基上进行活化，培养72 h后制成孢子悬液(1×108CFU/mL)。向NBRIP培养基中加入聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG)，制成极轻度(50 g/L PEG)、轻度(100 g/L PEG)、中度(200 g/L PEG)和重度(300 g/L PEG)干旱胁迫培养基[18]。取2 mL种子悬液分别接入到盛有100 mL NBRIP培养基的250 mL三角瓶中，同时设定不接种处理为对照(CK)，于摇床中振荡培养(28 ℃，160 r/min)，每处理3个重复。分别在培养的0，1，2，3，5，7，9，11，13 d测量溶磷量、pH、P1生物量。pH用酸碱度检测仪在室温(25 ℃)下测定。P1生物量测定前，向三角瓶中添加稀盐酸将剩余磷酸钙完全溶解，蒸馏水洗涤3次后再用真空抽滤机过滤，烘干称质量。取4 mL菌液于12 000 r/min离心5 min，上清液用钼蓝比色法测定磷含量。

1.4 温度胁迫下P1的溶磷能力测定

P1种子悬液的制备同1.3节。取2 mL P1种子悬液分别接入到盛有100 mL NBRIP培养基的250 mL三角瓶中，同时设定不接种处理为对照，分别于5，10，12，15，20，25，28，35，40 ℃摇床中振荡培养(160 r/min)，每处理3个重复。分别在培养的1，2，3，5，7，9，11，13，15，17 d测量溶磷量、pH、P1生物量，测定方法见1.3节。

1.5 数据处理

试验数据用“平均值±标准误”表示，采用Excel进行统计，采用Origin 8.0制图。

2 结果与分析

2.1 P1对绿豆种子萌发的影响

由表1可知，P1菌悬液对绿豆种子萌发有明显的促进作用；与CK相比，P1菌悬液使绿豆幼苗的芽长和发芽率分别极显著增长了149.14%和86.67%，绿豆幼苗的根长和鲜质量分别显著增长了50.21%和44.44%；与CK相比，P1菌悬液使绿豆幼苗的发芽势、发芽指数和活力指数分别极显著提高了95.33%，132.28%和237.25%；P1菌悬液处理与CK的干质量无显著性差异(P>0.05)。

表1 绳状青霉菌P1对绿豆种子萌发的影响

2.2 干旱胁迫对P1溶磷能力的影响

由图1可知，随着干旱程度的加剧，P1生物量下降，导致其最大溶磷能力逐渐降低。但是，P1溶解磷酸钙的能力依然很强，在重度干旱胁迫下的溶磷能力仍可达418.85 mg/L。在培养前5 d内，干旱胁迫处理的溶磷量大于对照，这可能是受干旱胁迫的影响，P1的产酸能力在生长初期增强，故其溶磷能力随干旱胁迫的增强而增大。

图1 干旱胁迫对绳状青霉菌P1溶磷能力的影响

2.3 培养温度对P1溶磷能力的影响

由表2和表3可知，P1在10～35 ℃下均能够生长，并具有溶磷能力，且在28 ℃时生物量最大，溶磷量在7 d后达到平台期，最大溶磷量可达1 120.52 mg/L。当培养温度低于28 ℃时，P1生物量和溶磷量均明显下降，并且进入平台期的时间点会后移，分析可能是由于温度低导致P1生长速率变慢，致使产酸速率降低，导致溶磷量下降。如表2，P1在10，12，15，20和25 ℃时在11 d后达到平台期，最高溶磷量分别为34.67，59.62，493.92，1 082.90和1 092.58 mg/L。当培养温度高于28 ℃时，P1的生物量和溶磷量也明显降低，P1在35 ℃时，最高溶磷量为364.97 mg/L，但最大溶磷量和生物量出现的时间点会前移，这与高温增加了微生物的生长速率，导致产酸速率提高有关。由此可见，温度低于或高于28 ℃时都会影响P1的溶磷能力。

表3 培养温度对绳状青霉菌P1生物量的影响

由表2～4可知，P1的溶磷能力与pH呈负相关关系，与生物量基本呈正相关关系，这说明生物量的累积会增加P1分泌有机酸或质子的数量从而促进溶磷，也进一步说明产酸是P1溶解磷酸盐的主要原因。

表2 培养温度对绳状青霉菌P1溶磷量的影响

表4 培养温度对绳状青霉菌P1 pH的影响

3 讨 论

种子萌发是植物生命周期中最关键的阶段之一，研究表明根际促生菌(PGPR)可促进种子萌发[25]。Yoo[26]研究表明，萝卜种子接种A.chroococcum孢子悬浮液(1×107CFU/mL)培养4 d后，与未接种对比，芽长提高了20 mm，根长提高了28 mm，发芽率提高了41.67%。Delgado-Sánchez等[27]的研究表明，真菌的孢子悬液有助于打破种子休眠期而提升发芽率。Zhao等[28]研究发现，接种HPP16菌悬液的绿豆发芽率比CK提高了35.48%。本研究中，P1对绿豆种子萌发的促生作用明显优于HPP16。菌株P1的菌悬液对绿豆种子萌发有较好的促生效果，可能是其菌悬液在接种至绿豆种子的4 d内，孢子萌发形成菌丝体，菌丝体释放生长素(IAA和铁载体)，促进了绿豆种子萌发。但是，大多数溶磷微生物只有在适宜的环境条件下才会正常溶磷[29]，恶劣的自然环境条件会严重影响微生物的代谢，从而影响其功能。P1如果具有良好的环境适应性，将是一株非常有潜力应用于农业生产的溶磷菌。因此，后续试验应对P1的环境适应能力进行研究。

干旱胁迫会严重影响微生物呼吸、生长和活性[16-17]。在本研究中，随着干旱程度的加剧，P1的最大溶磷能力逐渐降低，这与林凤莲等[18]的研究结果相似，但P1在重度干旱胁迫下的溶磷量仍然可达418.85 mg/L，是文献[18]中菌株P8和P19溶磷量的3倍多。

温度是影响微生物活性的重要因素，低温会对细胞膜、酶活性及DNA复制和细胞结构造成严重的破坏[30]。同样，温度过高酶会失去活性，使代谢发生障碍。因此筛选一株对温度适应性强的溶磷菌株在农业生产中有重大意义。巩文峰等[22]研究表明，溶磷菌株PSB19在4～30 ℃的条件下均能生长，但在20 ℃以下生长有所延迟。P1在10～35 ℃的条件下均能生长，在20 ℃以下生长延迟且生物量低，这是因为随着温度的降低,微生物细胞内的酶活性下降，使得代谢过程中各种生化反应速度减慢，破坏了生化反应的协调性，导致微生物的繁殖速度减慢[21]。但P1的解磷能力与同类菌相比仍然较高，梁艳琼等[31]的研究结果表明，黑曲霉PSFM在34 ℃下培养6 d后，发酵液中溶磷量达到317.45 mg/L，而菌株P1在35 ℃时溶磷量可达364.97 mg/L。

4 结 论

绳状青霉菌P1对绿豆种子萌发有良好的促生效果，使绿豆幼苗的芽长和根长分别增长了149.14%和50.21%，使发芽率提高了86.67%，种子活力指数提升了237.25%。P1在干旱胁迫下仍具有很强的溶磷能力，在重度干旱胁迫下溶磷量可达418.85 mg/L。P1在10～35 ℃的条件下均能生长且具备溶磷能力，10 ℃时溶磷量可达34.67 mg/L，35 ℃时溶磷量可达364.97 mg/L。由此可见，绳状青霉P1是一株对环境适应性较好且能促进植物生长的菌株，是制备微生物菌肥的良好菌种。