晾制温度对雪茄烟叶多酚类物质代谢的影响

卢绍浩，张嘉雯，赵 喆，钟 秋，张瑞娜，赵铭钦

(1河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2 四川省烟草公司德阳市公司，四川 德阳 618400)

多酚类物质是植物中重要的次生代谢物质，约占植物干叶质量的0.5%～2.5%，其中绿原酸、芸香苷和莨菪亭是最主要的酚类化合物[1-2]。多酚类物质对烟草的生长发育起着重要作用，同时也是香气物质的重要成分，不仅影响烟叶色泽，而且与烟气香吃味以及生理强度等密切相关[3]。研究发现，多酚类物质及其降解产物与烟草香吃味有关，其含量越高，烟草制品的等级越高，其中绿原酸是改善烟叶等级最主要的多酚类物质[4]。俞京等[5]研究表明，多酚类物质与香气特征指标的典型相关系数达显著水平，与口感特性和烟气特性指标的典型相关系数均达到极显著水平。因此合理调控烟叶内多酚类物质代谢，对提高烟叶内在质量及感官品质具有重要意义。

雪茄烟传统概念上是指用烟叶手工卷制的吸用烟卷，烟叶中的内含物质直接决定了雪茄烟的抽吸品质[6]。调制过程是雪茄烟叶内含物质转化的关键时期，不同的调制措施对烟叶内含物质的转化可产生不同效果。多酚类化合物在调制期间易发生酶促棕色化反应，形成醌类等棕色色素使叶片颜色加深，从而对烟叶的色泽和香气造成影响[7-8]。调制温度是烟草调制管理中一项重要的技术措施，其通过调控多酚氧化酶以及过氧化物酶等的活性和作用时间，进而影响多酚类物质的合成和转化[9]。目前，国内外科研人员对不同烘烤温度下烟叶多酚类物质代谢进行了大量研究[10-11]，相比较而言，雪茄烟叶晾制环境温和，烟叶内部生理生化反应缓慢，有关晾制温度对雪茄烟叶多酚类物质代谢的研究较为缺乏。本试验以雪茄烟叶为材料，研究了晾制温度对烟叶多酚类物质含量、相关酶活性以及化学成分的影响，旨在为优质雪茄烟叶调制技术优化及提高烟叶质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年在四川省什邡市大泉坑村雪茄烟叶生产基地(东经104°12′，北纬31°12′，海拔545 m)进行，该地区土壤为水稻土，地势平坦，肥力均匀，土壤pH为6.58，有机质含量34.92 g/kg，速效钾含量84.17 mg/kg，速效磷含量42.85 mg/kg，速效氮含量117.02 mg/kg。试验材料为当地主栽雪茄烟品种德雪1号。

1.2 试验设计

烟苗于2019-04-30移栽，行距120 cm，株距40 cm，烟田施氮量为180 kg/hm2，最终使m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶0.5∶3，按照当地优质雪茄烟叶生产技术规范统一管理。采收时选取大田长势以及叶片成熟度相对一致的烟株，以中部叶(第10～12叶位)为试验材料，将采收后的烟叶分别挂入低温(T1)、中温(T2)、高温(T3)的恒温恒湿箱中进行晾制，各处理重复3次，温湿度设定见表1。

表1 雪茄烟叶晾制过程中温度和相对湿度的设定

分别在雪茄烟晾制的5个时期(鲜叶期、凋萎期、变色期、定色期、干筋期，分别用S1,S2,S3,S4,S5表示)取样，每次随机选取各处理烟叶30片，分成2份：一份用锡箔纸和纱布包裹后置于液氮中，用于相关酶活性的测定；另一份去除主脉和叶尖，杀青后将其烘干磨碎过孔径250 μm(60目)筛，用于多酚类物质及化学成分含量的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 多酚类物质含量 烟草中多酚类物质含量采用YC/T 202-2006[12]的方法测定。

1.3.2 相关酶活性 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammoniolytic，PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、过氧化物酶(peroxidase，POD)活性分别用相应的试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)按说明书进行测定。分析酶活性与酸类物质含量的相关性。

1.3.3 化学成分 总糖、还原糖、淀粉、总氮、烟碱、蛋白质含量采用流动分析法测定[13]。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007进行数据整理及做图，运用SPSS 21.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 晾制温度对雪茄烟叶多酚类物质含量的影响

不同晾制温度处理下雪茄烟叶绿原酸、芸香苷和莨菪亭含量的变化如图1所示。由图1-A可见，不同晾制温度处理烟叶绿原酸含量的变化均呈先升高后降低趋势，且均在凋萎期(S2)达到峰值，此时低温、中温、高温处理烟叶的绿原酸含量分别为3.502，3.327和3.162 mg/g；烟叶进入变色阶段(S3)后绿原酸含量迅速降低，之后趋于稳定。在整个晾制阶段，T3处理的绿原酸含量均低于T1和T2处理，且除鲜烟叶期(S1)外均显著低于T1 处理，表明高温会加速烟叶内绿原酸的分解。由图1-B可知，晾制过程中，T1、T2处理烟叶的芸香苷含量均于S1～S3时期缓慢增加到峰值，之后含量急剧下降，而T3处理烟叶的芸香苷含量在晾制期间一直呈下降趋势。晾制开始时3个处理烟叶芸香苷含量差异不显著，但从S2时期开始，芸香苷含量表现为T1>T2>T3，且T1处理与T3处理差异显著。图1-C显示，在整个晾制过程中，莨菪亭含量明显低于绿原酸和芸香苷含量，且所有处理整体均呈下降趋势，但变化幅度较小。晾制过程中，T1～T3处理烟叶的莨菪亭含量分别为0.066～0.047，0.062～0.041和0.064～0.040 mg/g，其中以T3处理降幅最大，T1处理降幅最小。晾制期间各处理莨菪亭含量差异均未达到显著水平，说明不同晾制温度对莨菪亭含量的影响较小。

图柱上标不同小写字母表示同一时期不同温度处理间差异显著(P<0.05)。下同

2.2 晾制温度对雪茄烟叶多酚类物质代谢关键酶活性的影响

PAL、PPO和POD是植物多酚类物质代谢的限速酶，对代谢强弱起着关键作用。图2表明，晾制温度对多酚类物质的代谢水平具有显著影响，3种多酚类物质代谢相关酶活性总体均表现为T2>T1>T3。由图2-A可知，各处理烟叶PAL活性均在定色期(S4)达到峰值，其中以T2处理最大，T1处理次之，T3处理最低，相较于鲜叶期(S1)分别升高了3.11，3.03和1.88倍，之后活性迅速降低；处理间相比，除S1和S5时期无显著差异外，其他时期各处理间的差异均达到显著水平。图2-B显示，不同处理烟叶PPO活性在晾制过程中均呈先升高后降低的变化趋势，且均以凋萎期(S2)活性最高，此时T1、T2和T3处理烟叶的PPO活性分别为182.27，205.81和158.39 U/g，且处理间差异显著。图2-C表明，不同处理烟叶POD活性均在变色期(S3)达到峰值，此时T1、T2和T3处理POD活性分别较鲜叶期升高了82.09%，111.18%和83.66%，之后活性逐渐下降；在S2和S3时期，T2处理POD活性显著高于T1和T3处理，在S1和S5时期各处理间差异不显著。总体而言，不同处理烟叶的PPO、POD和PAL酶活性的峰值均分别出现在凋萎、变色和定色阶段，说明雪茄烟叶的酶促棕色化反应主要发生在凋萎期至定色期。

图2 不同晾制温度处理雪茄烟叶PAL、PPO和POD活性的变化

2.3 晾制过程中多酚类物质与酶活性的相关性分析

晾制过程中雪茄烟叶多酚类物质与关键酶活性的相关性分析结果见表2。由表2可知，不同处理间烟叶多酚类物质含量与其代谢酶活性之间的相关性存在一定差异，T2处理的相关性优于T1和T3处理。各处理绿原酸含量与PAL活性均呈显著负相关关系；与PPO活性均呈正相关关系，但只有T2处理达显著水平；与POD活性均呈正相关关系，但相关性均不显著。各处理芸香苷含量与PAL活性关系不明显，与PPO活性均呈极显著正相关关系，与POD活性呈显著或极显著正相关关系。各处理莨菪亭含量与PAL活性均呈负相关关系，与PPO和POD活性均呈正相关关系，但均未达到显著水平。

表2 晾制过程中雪茄烟叶多酚类物质与关键酶活性的相关性分析

2.4 晾制温度对雪茄烟叶化学成分的影响

优质雪茄烟叶具有糖含量较低、烟碱含量较高的特点。由表3可知，3个晾制温度处理中，T2处理烟叶的总糖和还原糖含量最高，分别为15.44和9.53 mg/g，而淀粉含量显著低于T1和T3处理，表明适宜的晾制温度能促进淀粉的转化，有利于总糖和还原糖的积累。蛋白质含量表现为T3>T1>T2，T1与T2差异不显著，而总氮和烟碱含量处理间相差不大。氮碱比是评价烟叶感官质量最重要的指标，其值越接近1烟叶质量越好。本试验3个处理的氮碱比为1.33～1.51，其中T3处理最高，T2处理显著低于T1和T3。3个处理的糖碱比表现为T2>T1>T3，说明在合适的晾制温度下，雪茄烟叶碳氮代谢较为完善，内在化学成分较为协调。

表3 不同晾制温度处理雪茄烟叶化学成分的变化

3 讨 论

多酚类物质主要以酯和葡萄糖苷的形式存在于雪茄烟叶中，其比例和含量对烟叶外观质量和抗氧化能力都有重要影响[10,14]。尹建雄等[15]研究表明，烟叶经过较长时间的调制，特别是晾制过程，多酚类化合物会被破坏，含量减少。本试验结果表明，雪茄烟叶中多酚类物质含量总体表现为先上升后降低趋势。这是由于晾制初期木质素发生热解转化导致多酚类物质含量上升，而后期由于酶促棕色化反应及活性氧的氧化作用使其含量迅速减少[16]。其中绿原酸含量在凋萎期达到峰值后急剧降低，可能与凋萎期PPO活性升高有关。与绿原酸含量变化相似，晾制过程中各处理芸香苷含量也呈先升高后降低的变化规律，但由于绿原酸在酚类物质降解中起着主导作用[17]，因此芸香苷含量峰值出现的时间较绿原酸推迟。不同处理间相比，高温条件下烟叶内的膜脂过氧化水平较高，细胞内的活性氧含量高于中温和低温处理，一部分多酚类物质被活性氧氧化[18]，因此在晾制过程中，高温处理绿原酸和芸香苷含量最低，且高温处理芸香苷含量下降时间早于中温和低温处理。晾制期间低温处理烟叶的绿原酸和芸香苷含量均高于中温处理，这是因为中温条件下PPO活性高，促进了多酚类物质的转化与分解。与绿原酸和芸香苷含量变化不同，晾制过程中莨菪亭含量一直呈下降趋势，但整体变化平缓，且各处理间差异均未达到显著水平，表明晾制温度对莨菪亭的影响较小。雪茄烟叶调制时间较长，因此多酚类物质被氧化较多而导致其总体含量较低，使得烟叶的颜色变褐变深。与烤烟不同，雪茄烟叶发生的棕色化反应对烟叶质量不但无明显危害，而且还可提高烟叶的外在质量和内在品质，在一定程度上促进雪茄烟叶中多酚类物质的转化，提高烟叶质量。

多酚类物质代谢与相关酶活性紧密相关[19]，PAL是催化苯丙烷类代谢的第一关键酶，与多酚类化合物和木质素等植物抗病物质的合成息息相关[20]。本研究中，随着晾制的进行，不同处理烟叶PAL活性均呈单峰变化，于定色期达到最高。这可能是因为在晾制前期，膜脂过氧化水平逐渐升高，烟叶中苯丙烷类代谢被激活，促使PAL活性上升，产生酚类及木质素等来减轻伤害，晾制后期烟叶膜脂过氧化程度加剧[21]，导致PAL活性急剧降低。在烟草中，PPO是一类铜结合酶，可催化各种多酚类物质氧化成醌，进而影响烟叶的色泽和香吃味[22]，调制过程中其活性与烟叶含水率关系密切[23]。本试验结果表明，晾制过程中烟叶PPO活性呈单峰变化，在凋萎期达到峰值。这可能是由于晾制初期烟叶水分流失，膜脂过氧化水平升高，烟叶生物膜系统被破坏[24]，导致烟叶中的部分水分向叶绿体流动，使PPO所处的环境水分相对增加，所以PPO活性在凋萎期达到最大，而进入变色阶段后烟叶水分大量散失，导致其活性下降。POD属于PR蛋白的PR-9家族成员，可催化分解植物体内的H2O2，与PAL和PPO同属于细胞防御酶系统[25]。调制阶段烟叶内膜脂过氧化水平逐渐增加，此时POD活性随之增强，以清除多余的活性氧自由基来改善烟叶的内部环境[26]，同时POD活性的上升也伴随着酚类物质的氧化，进而引起烟叶的褐变，因此在变色期POD活性到达峰值，这标志着雪茄烟叶变色期结束，进入定色阶段[27]。与PAL和PPO活性相比，POD活性始终保持在较高水平，表明POD在抗氧化反应中占主导作用[28]。本试验发现，高晾制温度和低晾制温度处理均使多酚类物质代谢关键酶的活性一直处于较低的水平，这可能是高晾制温度条件下，烟叶失水过快，膜脂过氧化水平升高[29]；而在低晾制温度处理下，烟叶呼吸作用弱，体内有机物代谢减慢，释放出的能量变少，抑制了酶的合成[30]。因此，晾制期间合理控制晾制温度，有利于提高烟叶多酚类物质代谢的能力，保持酚类化合物的充分转化，对提高雪茄烟叶品质有重要意义。

通过分析不同晾制温度条件下雪茄烟叶多酚类物质代谢相关酶与酚类化合物含量之间的相关性可知，各晾制温度条件下的绿原酸含量与PAL活性均呈极显著负相关，说明PAL活性变化对绿原酸的分解和转化起重要作用。芸香苷含量与PPO活性呈极显著正相关，与POD活性呈显著正相关，而与PAL活性相关性不显著，这说明雪茄烟叶中芸香苷的代谢主要受PPO及POD的调控。而前人研究发现，芸香苷的转化在一定程度上与PAL有关[31]，但本试验中二者关联性不强，说明其可能还受到其他因素的影响。在各处理中，雪茄烟叶的莨菪亭含量与PAL、PPO、POD活性之间关联性较弱，说明莨菪亭含量的变化并不完全是受酶活性的影响，还与其他因素有关，这有待进一步研究。

4 结 论

雪茄烟叶晾制过程中，在各晾制温度条件下，烟叶的PAL、PPO和POD活性及绿原酸和芸香苷含量均呈先升高后降低的变化趋势，而莨菪亭含量则一直逐渐降低。对雪茄烟叶多酚类物质与相关酶活性的相关分析结果表明，绿原酸代谢主要受PAL调控，芸香苷的代谢与PPO和POD相关性较大，而莨菪亭与PAL、PPO和POD相关性较小。不同处理间综合比较，在烟叶调制的凋萎期、变色期、定色期、干筋期将温度分别控制在28，33，38和38 ℃，烟叶内的PAL、PPO和POD活性最高，绿原酸、芸香苷和莨菪亭含量适中，可以保证烟叶内酶促棕色化反应的正常进行，且烟叶整体化学成分更协调，调制后烟叶品质提高。本研究结果为雪茄烟叶调制工艺的优化奠定了基础。