不结球白菜分蘖调控基因BcMAX1的同源克隆及功能分析

张玮,郭明亮,龙言,黄菲艺,侯喜林,李英

(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/园艺学院,江苏 南京 210095)

不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)是我国重要的叶菜类蔬菜,其中有一种特殊种质材料为分蘖菜[1],它既有单子叶植物的分蘖特性又具有双子叶植物的分枝特点[2],即在腋芽形成后不经过休眠阶段就开始发生分蘖,植株总叶片数极多,可以分批采摘[3],它的独特优势决定了其会成为不结球白菜未来育种的优质材料。因此,研究不结球白菜分蘖性状及内在分子机制可以为未来的育种工作打下良好的基础。

独脚金内酯(strigolactone,SL)最早发现于根系分泌物中[4],它可以通过木质部向上运输至地上部分参与调控植物株型[5]。近几年的研究发现SL主要以一种生长素依赖的方式来调节腋芽分枝[6-8]。之前在水稻上的研究已经鉴定出几种突变体在SL的生物合成中存在缺陷(D3/D10/D14/D27/D53),它们表现为高分枝、矮化[9],但同时SL也会参与不同的发育过程,如表皮细胞分化、木葡聚糖代谢过程、休眠过程、刺激反应、核酸酶转运等[10]。

近年来,对于独脚金内酯的研究愈加深入,研究发现在单子叶和双子叶植物中,其抑制植物分枝的调控模式以及功能基因都存在高度保守性,特别是参与MORE AXILLARY(MAX)途径中的基因,目前已经在4种模式植物(拟南芥、豌豆、水稻和矮牵牛)中鉴定到独角金内酯依赖MAX途径完成合成及信号转导从而参与分枝的调控机制[11]。MAX家族基因会改变腋芽的休眠状态[9],即在腋芽发生后不经过休眠阶段直接进入下一步生长阶段,这与不结球白菜分蘖菜‘马耳头’的表型是一致的,推测MAX家族基因可能为‘马耳头’特殊分蘖性状形成的重要基因。其中MAX1在木质部作用于MAX3/MAX4下游1个可以移动的底物产生类胡萝卜素衍生物,参与SL的合成,直接或间接抑制植物分枝发育[12-14];MAX2编码1个含有富含亮氨酸重复序列的F-box蛋白[15],D14编码α/β水解酶家族成员[9],二者均参与SL的信号转导。

研究发现,在拟南芥中MAX1是通过催化连续的氧化作用将内酯(calactone,CL)转化为内酯酸(calactone acid,CLA),之后再合成SL,并且其甲酯在体外可与AtD14直接发生相互作用[16]。另外,D14和MAX2均被认为作用于MAX1的下游,并且二者编码的蛋白存在相互作用[17]。

本研究以不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’为材料,同源克隆大白菜BcMAX1(LOC103858373)基因及其启动子,并对其进行生物信息学分析;同时检测BcMAX1在‘马耳头’和‘苏州青’不同时期不同组织中的表达差异,并利用BcMAX1过表达拟南芥转基因植株和不结球白菜沉默植株对BcMAX1基因的功能进行初步研究,旨在进一步探究不结球白菜独角金内酯的调控机制,为不结球白菜高产育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为不结球白菜品种‘马耳头’(分蘖品种)和‘苏州青’(不分蘖品种)以及Col生态型拟南芥,由南京农业大学白菜系统生物学实验室提供。分别于不结球白菜苗龄30、50和70 d时选取生长整齐一致的植株,取根、茎、叶片和腋芽,液氮速冻后-80 ℃保存。拟南芥和用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验的‘苏州青’种植在人工气候室中。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA和DNA的提取以及cDNA和gDNA的合成参照植物总RNA和基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)分别提取2个不结球白菜品种的RNA和DNA以及拟南芥的RNA,4 ℃冷却后 -80 ℃保存。以2个品种叶片的总RNA和DNA为模板分别按PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书分别合成cDNA和gDNA。

1.2.2 不结球白菜BcMAX1基因的同源克隆及生物信息学分析从大白菜数据库检索出BcMAX1基因序列,设计1对特异引物BcMAX1-F和BcMAX1-R(表1),以上述cDNA为模板进行PCR反应。用ORF finder查找BcMAX1的开放阅读框(ORF);利用Predictprotein分析BcMAX1编码蛋白的生化信息并预测其二级结构。

1.2.3 MAX1蛋白的系统进化树构建及保守结构域分析采用MEGA 7软件构建系统进化树,通过MEME分析不同物种中MAX1蛋白的保守结构域,并用TBtools软件对其进行整合分析。

1.2.4 不结球白菜BcMAX1启动子的同源克隆与序列分析在大白菜数据库中检索出BcMAX1启动子序列,设计1对引物BcMAX1-P-F和BcMAX1-P-R(表1),以上述基因组DNA作为模板进行PCR反应。PCR反应体系为:PrimeSTAR Max Premix 10 μL,正、反引物各1 μL,模板DNA 100 ng,补水至20 μL。PCR反应程序为:98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s,55～65 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共35个循环;72 ℃ 10 min。采用PlantCARE软件[18]进行序列分析。

表1 PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.2.5BcMAX1过表达载体的构建及转基因拟南芥的获得首先将测序正确的BcMAX1基因克隆产物连接到经BamHⅠ和SacⅠ双酶切的植物过表达载体pTCK303(本实验室保存)中,得到重组载体pTCK303-BcMAX1。将重组载体转入农杆菌并通过蘸花法得到转基因拟南芥T0代,再经过2次抗性筛选得到T2代。

1.2.6BcMAX1沉默载体的构建及沉默植株的获得从BcMAX1的编码区挑选一段40 bp的特异序列,将其与它的反向互补序列合成1个80 bp的发夹结构序列,随后将其插入pTY载体(本实验室保存)得到BcMAX1沉默载体并测序验证。同时设置对照即pTY空载。该40 bp的特异序列为:5′-ATGAAGACGCAACATTTATGGTGGGATGTTCTTAATCTATATAGATTAAGAACATCCCACCATAAATGTTGCGTCTTCAT-3′。采用1月龄的‘苏州青’用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验,通过基因枪法导入病毒。试验重复3次,每个重复8株苗。将植株移至25 ℃、相对湿度为75%的气候室中,大约20 d后,选取有感病症状的叶片观察并分析其沉默效率。

1.2.7 定量PCR分析使用NCBI设计荧光定量特异性引物qRT-BcMAX1-F和qRT-BcMAX1-R,采用2-ΔΔCT法计算不同分蘖时期不同组织(根、茎、叶片和腋芽)中BcMAX1的表达量,以30 d苗龄‘苏州青’根中的表达量为对照。同时测定BcMAX1过表达拟南芥转基因植株和不结球白菜沉默植株中BcMAX1及独角金内酯响应基因BcMAX2和BcD14的表达水平,以野生型植株作为对照。以Actin1和Actin2基因作为不结球白菜和拟南芥的内参,引物见表1。3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 不结球白菜BcMAX1基因的同源克隆和不同物种MAX1的系统进化分析以及保守基序分析

以不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’的cDNA为模板进行克隆,2个序列完全一致。序列分析表明,不结球白菜BcMAX1包含1个1 593 bp的开放阅读框(ORF),编码531个氨基酸。BcMAX1蛋白质的分子式为C2781H4362N720O756S13,理论等电点(pI)为9.26,不稳定指数为34.65,属于稳定蛋白,脂肪酸系数为100.4。预测该蛋白无信号肽,但存在跨膜区域。

对22个物种(包括16个双子叶植物和6个单子叶植物)中的MAX1进行进化树分析,结果(图1-A)显示,不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)的BcMAX1与同为芸薹属的欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoleracea)的MAX1相似性高达100%;与同为十字花科的萝卜(Raphanussativus)中的MAX1相似度高于94%;与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、亚麻芥(Camelinasativa)、高山南芥(Arabisalpina)中的MAX1相似性均为80%左右。在22个MAX1蛋白中共发现15个motif(图1-B)。其中,motif 1—motif 9为共有motif,motif 10、motif 11仅存在于双子叶植物中,并且motif 11只存在于十字花科植物中,而motif 13和motif 14为单子叶植物所特有。motif 12在某些植物中缺失,motif 15仅存在于单子叶植物和苜蓿中。

图1 不同物种中MAX1蛋白的系统进化树和保守基序分析Fig.1 Phylogenetic and conserved motifs analysis of MAX1 proteins in different species A. 系统进化树;B. 保守基序示意图;C. 基序信息。B图中每个图案由右边编号的彩色框表示,不同蛋白质中的相同数字指的是相同的基序。A. Phylogenetic tree;B. Schematic of conserved motifs;C. Detailed information about motifs. Each motif was represented by a coloured box numbered at the right,the same number in different proteins referred to the same motif in figure B.

2.2 不结球白菜BcMAX1启动子的同源克隆与序列分析

本试验克隆得到的BcMAX1启动子全长为2 005 bp,包含多个决定基因转录起始的TATA-box;决定转录效率的CAAT-box;涉及干旱诱导的MYB;5个光响应因子:3-AF1 binding site、CAG-motif、GA-motif、TCCC-motif和TCT-motif;以及4个顺式作用元件:ARE、CAT-box、GCN4_motif 和TC-rich repeats;除此之外,还有多个未知功能的MYB和MYC结合位点(表2)。

表2 BcMAX1启动子基序分析Table 2 Promoter motif analysis of BcMAX1

2.3 不同生长时期不结球白菜组织中BcMAX1的表达量

如图2所示:BcMAX1在不同生长发育时期的不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’的根、茎、叶片和腋芽中均有表达。在30 d(‘马耳头’未发生分蘖)时,BcMAX1在‘马耳头’和‘苏州青’各个组织中的表达量都很低;在50 d(‘马耳头’分蘖开始发生)时,BcMAX1的表达量开始升高,且‘马耳头’各个组织中的表达量均高于‘苏州青’;在70 d(‘马耳头’分蘖期)时,BcMAX1在‘马耳头’和‘苏州青’的各个组织中的表达量均降到极低。

图2 不同生长时期BcMAX1在‘马耳头’和‘苏州青’不同组织中的相对表达量Fig.2 Relative expression of BcMAX1 of different tissues in ‘Maertou’and ‘Suzhouqing’ at different growth stages** P<0.01. The same as follows.

2.4 拟南芥过表达BcMAX1表型观察及相关基因的表达分析

拟南芥进入生殖生长即抽薹开花之后,腋芽打破休眠发育为侧枝。由图3和图4-a可见:过表达BcMAX1(pTCK303-BcMAX1)植株中莲座叶数目少于野生型植株,且只有主枝抽出;而野生型拟南芥中已经开始形成侧枝,说明BcMAX1会抑制侧枝的发育。

图3 野生型和过表达植株BcMAX1抽薹后植株的表型Fig.3 Phenotype in wild type(WT)and overexpression plants after bolting stageA、C. 野生型植株;B、D. 过表达BcMAX1植株(M:主茎;SB:茎生叶侧枝;SL:茎生叶)。A,C. WT plants;B,D. BcMAX1 overexpression plants(M:Main stem;SB:Stem leaf lateral branch;SL:Stem leaf).

对野生型植株和BcMAX1过表达植株中的BcMAX1及独角金内酯响应基因BcMAX2和BcD14进行实时荧光定量分析发现,过表达植株中BcMAX1表达量显著升高,BcMAX2和BcD14的表达量比野生型显著提高(图4-b—d)。

图4 野生型和过表达植株抽薹后BcMAX1及相关基因的表达分析Fig.4 Expression analysis of BcMAX1 and related genes in WT and overexpression plants after bolting stage

2.5 不结球白菜BcMAX1基因沉默后相关基因的表达分析

由图5可见:转入pTY-BcMAX1或pTY的‘苏州青’叶片相对野生型(WT)植株的叶片明显褪绿,表现出芜菁黄色花叶病毒的典型症状。实时荧光定量PCR检测结果(图6)显示:转入pTY-BcMAX1重组质粒的‘苏州青’中BcMAX1的表达量与对照植株相比降低61%,BcMAX2表达量比对照降低70%,BcD14表达量比对照降低29%,表明BcMAX1表达量的改变会调节独角金内酯响应基因的表达水平。

图5 野生型与侵染 pTY 或pTY-BcMAX1后 发病植株的表型Fig.5 Phenotype of WT and diseased plants after being infected with plasmid pTY or pTY-BcMAX1

图6 侵染pTY或pTY-BcMAX1后发病植株中BcMAX1基因及独角金内酯响应基因的表达分析Fig.6 Expression analysis of BcMAX1 gene and strigolactones response genes in the diseased plants after being infected with plasmid pTY or pTY-BcMAX1

3 讨论

本研究分别从不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’中克隆了BcMAX1基因和启动子序列,且序列比对完全一致。研究表明max突变体在拟南芥、豌豆、矮牵牛和水稻中均有发现[11],说明独脚金内酯在单子叶和双子叶植物中抑制植物分枝的调控模式和功能都存在高度的保守性。本研究中MAX1的系统进化分析和保守结构分析也验证了这一观点。

本试验表明,BcMAX1在不结球白菜‘马耳头’和‘苏州青’不同生长发育时期的各个组织中均有表达,推测该基因的调控存在于不结球白菜多个组织中,并可能作用于一种从根部到茎部最后到达植物叶片和腋芽的可移动物质[12-14,19]。随着腋芽的形成到分蘖发生,BcMAX1在‘马耳头’和‘苏州青’中的表达量表现为先升高后降低,说明该基因与分蘖有密切的联系。BcMAX1基因主要作用于叶片和腋芽部位,在腋芽发育成为分蘖的过程中发挥作用,该基因在不结球白菜整个生长发育时期表现为抑制分蘖的发生,并且在‘苏州青’中表现出更强的抑制作用,这也与之前的研究结果[2]一致。

在本研究中,过表达拟南芥株系中侧枝生长受到抑制,莲座叶数目少于野生型植株,并且抽薹时间早于野生型植株。沉默BcMAX1基因并没有促进‘苏州青’侧枝的发生,可能是由于VIGS的沉默效果维持时间不够或随着植物体内防御系统的启动,VIGS被减弱或消除因此没有得到相应的表型,也有可能是沉默效率不足以引起表型的明显变化[20]。过表达拟南芥植株中BcMAX1及独角金内酯响应基因BcMAX2和BcD14的表达量升高,而在不结球白菜沉默植株中表达量下降,说明BcMAX1表达量的改变确实会调节独角金内酯响应基因的表达,但BcMAX1基因与独角金内酯的关系及其对分蘖的影响还需要进一步研究。在今后的工作中,还需要利用转基因技术得到BcMAX1的缺失突变体,进一步来研究它的功能,同时挖掘潜在的分子机制。

此外,与MAX途径中的基因相关的基因也逐渐在其他物种中被发现:例如MAX途径上游基因MODERATELYINCREASEDTILLER3(MIT3)[21]、SL/MAX2诱导油菜素甾醇降解从而调控分枝的BRI1EMSSUPPRESSOR1(BES1)[22];TCP家族转录因子TEOSINTEBRANCHED1(TB1)[23];与OsTB1互作并作用于DWARF14(D14)从而控制水稻腋芽发生的蛋白OsMADS57(MADS转录因子)[24];被DWARF53(D53)抑制的SL下游转录因子IDEAL PLANT ARCHITECTURE 1(IPA1)及其编码蛋白的互作蛋白IPA1 INTERACTING PROTEIN1(IPI1)、DENSE AND ERECT PANICLE1(DEP1)和WRKY45(WRKY转录因子),其中IPI1功能丧失突变体植株表现出分蘖数增加[25-27]。寻找调控不结球白菜分蘖性状的关键基因,分析其对分蘖的作用及调控途径,是未来选育不结球白菜优良品种和利用基因工程进行育种的关键。