循环肿瘤DNA在Ⅱ期结肠癌治疗风险评估中应用的研究进展

肖蓉蓉，夏 天，李淳一综述，黄新恩审校

0 引 言

结肠癌发病率目前是第四常见恶性肿瘤[1]。在结肠癌中，肿瘤分期主要基于原发肿瘤以及淋巴结和有无远处转移分类，该分类已被接受50多年，该系统根据肿瘤的原发和区域性淋巴结转移程度以及是否存在转移，为肿瘤切除后的预后提供了明确的指示。Ⅱ期结肠癌术后(包括辅助化疗和不辅助化疗的患者)5年总生存率为70%～80%[2]。大量研究已表明辅助化疗可改善II期结肠癌患者的生存期，但与风险相比，获益较少，不推荐低风险II期结肠癌行术后辅助治疗，然而高风险II期结肠癌可从中获益[3-4]。因此，辅助治疗前的风险评估极其重要。目前肿瘤分期需要结合影像学的证据才可对病情进行评估。而ctDNA可以在影像学表现前被检出，且检查方便。而对于高风险的结肠癌目前仍无明确的定义，也无明确统一的治疗策略。本文就ctDNA作为生物指标对II期结肠癌的治疗的指导作用作一综述。

1 现 状

全世界每年大约诊断出130万例大肠癌病例[5]。目前结肠癌认为的高风险因素: T4(ⅡB、ⅡC期)、组织学分化差(3/4级，不包括MSI-H者)、脉管浸润、神经浸润、术前肠梗阻或肿瘤部位穿孔、切缘阳性或情况不明、切缘安全距离不足、送检淋巴结不足12枚[5]。循环肿瘤细胞，循环肿瘤DNA，RNA，微泡，包括外泌体等均被实验确定为癌症患者基因组信息的来源，可反映原发性和转移性病变中存在的所有亚克隆，从而可连续监测疾病的进展[6]。目前已有研究发现生物学标志物与结肠癌的预后相关，如外泌体微小核糖核酸[7-8]等，但仍未应用于临床。早期结肠癌的当前治疗模式包括在一组选定的患者中进行手术，然后进行辅助化学疗法，其目的是根除最小的残留疾病以实现治愈。绝大部分结肠癌患者仅靠手术就能治愈。当前,手术和辅助化学疗法可在约三分之二的淋巴结转移结肠癌患者中实现长期生存[9]。

2 循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 是来自肿瘤细胞的循环游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)片段。cfDNA被认为是疾病负担一个“实时”快照，由肿瘤患者血中肿瘤细胞凋亡，坏死，激活时释放，cfDNA在循环中的半衰期约为十几分钟到几个小时[10]。cfDNA释放入循环后，cfDNA在肾、肝和脾中被迅速清除[8]。ctDNA通常是通过检测体细胞变异体推断出的，从肿瘤细胞释放到血液中，且原则上含有与肿瘤细胞相同的遗传缺陷。因此，可在肿瘤中鉴定出的分子变化包括点突变，重排，扩增，甚至是基因拷贝数变化。ctDNA可从血液中快速清除，可通过微创方法获得，因此可用作肿瘤生物学的动态生物标记，一些研究表明治疗期间ctDNA水平的波动可能有助于监测癌症治疗的效果[11]。鉴于结肠癌患者使用精准药物有限，ctDNA检测已成为评估结肠癌的潜在工具，具有最小的侵入性，快速的周转时间和低成本的采样程序等优势，使临床能够迅速指导患者进行最佳治疗，并可能通过多次采样实施治疗变化来监测耐药性。但仍存在一些局限性，ctDNA主要局限性是与组织分析相比的敏感性和特异性以及ctDNA分析不能分析除基因组改变以外的生物标志物，如微小核糖核酸。

3 CtDNA检测方法

ctDNA中可检测到的遗传和表观遗传变化类型包括:突变、甲基化、拷贝数变化和结构变化或重新排列。ctDNA的分析从点突变分析到全基因组分析不等,许多肿瘤患者外周血液中测得的ctDNA含有与实体肿瘤细胞相同的分子突变。但是传统的DNA分析方法(如Sanger测序)的敏感性不足。ctDNA在血液循环中浓度仍然很低，且以碎片化的方式存在肿瘤患者的血中，ctDNA的检测仍具有极大的挑战。目前检测方法包括：数字微滴聚合酶链反应 (droplet digital PCR，ddPCR)、基于磁珠固相扩增的乳滴数字聚合酶链反应和高通量测序(next generation sequencing,NGS)、突变扩增系统、全基因组测序以及全外显子测序等。ddPCR使用液滴生成器，对每个分子的靶序列进行单独分析，从而可检测突变或野生型DNA片段，该方法检测同一样品的多个突变具有高度灵敏度(0.05%至0.001%)[12]，但若检测5至10个不同的靶序列则较为复杂[9]。基于磁珠固相扩增的乳滴数字聚合酶链反应方法灵敏度约为0.01%，该方法相当复杂，几乎不能用于常规分析[12]。因此，这些方法通常应用于研究少量突变，并且通常用于分析癌症点突变。靶向测序可使用PCR扩增子或杂交获取，高灵敏度检测多个基因，测序范围可从单个目标外显子(千碱基)到整个外显子组(约50兆碱基)，在等位基因低于0.1%的情况下也可测出突变[13]。NGS是一种能够通过在测序之前将靶基因/区域与反义寡核苷酸杂交来确定需要的基因组区域，是一种高敏感的可检测多个突变的措施，但目前检测价格昂贵，因此需进一步发展以降低成本[14-17]。突变扩增系统是一种利用引物与模板DNA互补进行扩增，高特异性，高灵敏性，操作简单，耗时短，成本低，但特异性取决于引物，需要已知突变，在一定程度上应用有所限制[14-16,18]。

4 ctDNA的水平与分期

目前，ctDNA水平随着结肠癌分期的升高而升高，且已知有驱动基因改变：APC, KRAS和TP53突变的早期患者较突变阴性患者的ctDNA有明显增高。使用ddPCR方法，发现ctDNA在结肠癌相比其他实体肿瘤的患者中更易检测[19]。这为ctDNA在结肠癌早期疾病研究提供了一定的线索。且结肠癌术后和化疗后仍具有高复发风险的患者，ctDNA仍可被检测到，这为探索其他治疗方法提供了独特的机会[20]。但是目前大量的临床实验采用的方法不同，急需具有统一方法的大型前瞻性随机对照临床研究的数据来进一步证实。

5 ctDNA定量测试和癌症分期预测

一项前瞻性实验，甲基化BCAT1和/或IKZF1DNA标记ctDNA，以此来检测血中的ctDNA[19]。模拟疾病的严重程度(非癌症，早期癌症，晚期癌症)和甲基化的分数之间的关系。甲基化BCAT1和IKZF1 DNA分数随肿瘤侵入程度的增加而增加。设计模型，对于给定的甲基化分数值，计算相对于非癌症疾病，早期或晚期癌症的相对风险。这些模型表明，如果未检测到甲基化，则患癌症的相对风险较低[21]。对于含有约5%甲基化的BCAT1和IKZF1 DNA模型估计的风险为具有早期癌症，另一方面，如果甲基化程度约为40%，则患晚期癌症的相对风险则较高[21]。这些研究表明，ctDNA与结肠癌风险高低有关系，表明可通过定量测定ctDNA为患者行风险分层评估。计算甲基化分数值，可相对计算患者是否为高危险人群而为治疗决策提供意见。

6 微小残留病灶的替代指标

切除Ⅱ期结肠癌后检测循环肿瘤DNA可能会发现复发风险最高的患者，并有助于告知辅助治疗决策。有研究回顾了ctDNA在结肠癌中的使用，发现血浆中可检测到ctDNA的患者与无ctDNA的患者相比，血浆中的总体生存期和无进展生存期较差，切除后不存在ct DNA与改善预后和降低复发风险有关[8]。目前治疗结束后的二期结肠癌通常需通过癌胚抗原(carcinoembryonic antige，CEA) 和电子计算机断层扫面(computed tomography,CT)监测随访。CT对鉴别微转移病灶不够敏感，且有频繁暴露于辐射和造影剂的相关风险，随访检测具有局限性。选择更敏感以及更简易的方法是目前的难题。追踪和量化关键基因的突变，如APC、KRAS和TP53等已知基因，可在早期CRC中发挥作用，是识别微小残留病和复发性疾病的一种有希望的策略。甲基化IKZF1和BCAT1通常在血液中被标记来检测ctDNA，ctDNA存在于Ⅱ结肠癌患者血中，大多数患者ctDNA在手术后会消失[22]。可予检测已知基因的ctDNA可及时评估出患者具有高风险，考虑是否应该予以进一步辅助治疗。最近，在一项以肿瘤测序选择突变，该试验包括230名Ⅱ期结肠患者，对每个患者选择突变等位基因分数相对最高的突变，追踪测定该ctDNA[23]。52例(23%)患者接受了辅助化疗，其中6例术后检测到ctDNA。在这些病例中，6例中有5例在辅助化疗的初始阶段无法检测到ctDNA，其中有2例在完成辅助化疗后可再次检测到ctDNA，均在ctDNA检测后343d及472d出现放射学复发[23]。该实验表明化疗结束后检测ctDNA与无复发生存率相关(P=0.001)。在未接受辅助化疗的患者中，178例(7.9%)患者中有14例术后检测到ctDNA，其中11例(79%)在中位随访27个月后复发[5]。本研究的局限是仅追踪1个突变，这影响评估ctDNA检测分析的灵敏度。此外，在结肠癌患者中也发现了肿瘤内体细胞突变的异质性[23]。因此，从理论上讲，应该选择跟踪1个癌症内所有癌细胞中可能存在的突变进行ctDNA跟踪，否则可能导致假阴性结果。同时,应考虑到单次活检研究不能可靠地评估克隆性，因此最好同时检测多个突变。一项前瞻性研究以确定Ⅱ期结肠癌患者手术后检测这些标志物与残留疾病和复发风险之间的关系[11]。12个月内手术切除的结肠癌患者以研究ctDNA中甲基化IKZF1和BCAT1 与残留病灶风险和无复发生存期的相关性。172名结肠癌术后患者采集ctDNA并随访，进行多变量建模，具有高复发风险特征患者的ctDNA阳性率是其他患者的3～5倍，手术后ctDNA阳性与复发风险存在统计学意义(HR 3.8，1.5～9.5，P=0.004)，即两者存在相关性[12]。表明术后甲基化ctDNA阳性与结肠癌患者残留疾病和随后复发风险的增加相关。上述结果支持二期结肠切除术后ctDNA检测可能是残留病灶的替代指标，并可识别出复发风险高的患者。综上，可通过检测Ⅱ期结肠癌患者术后的ctDNA水平，评估有无残留病灶，以协助诊断该患者是否为高风险患者，以确定是否需进一步治疗。

7 辅助化疗与ctDNA水平

一项来自于2017年的230名Ⅱ期结肠癌患者的的随机临床实验中，前瞻性队列研究，检测1046血浆样本中最小残留疾病的能力。在接受化疗的患者中，化疗完成后ctDNA的存在与无复发生存期存在统计学意义，两者相关(HR，11； 95%CI，1.8～68；P=0.001)[23]。178例Ⅱ期结肠癌患者术后未经化疗的患者中有14例在手术后检测到ctDNA,在这14例患者中有11例在随访期间影像学发现了复发证据(78.6%);178名患者中的其余164名(92.1%)术后ctDNA阴性，据报道16名患者疾病复发(9.8%)[24]。在Ⅱ期结肠癌患者术后接受辅助化学疗法治疗的所有患者中，复发的27例中有2例(7.4%)的术后CEA升高，而未复发的151例中有5例(3.3%)的CEA升高。术后可检测到ctDNA的患者均未出现CEA升高，说明ctDNA有独立的检出意义，表明Ⅱ期结肠癌切除后的ctDNA检测可作为残留疾病的直接证据，并可依此结合其他临床证据来筛选复发风险高的患者[13]。未经化疗ctDNA阳性的Ⅱ期结肠癌患者术后复发的风险极高，该风险高于常规接受辅助治疗的Ⅲ期大肠癌患者，相反，术后ctDNA阴性的患者发生影像学复发的风险较低，与Ⅰ期大肠癌患者无异，可用来确定不太需要辅助治疗的人群[23]。将患者分为临床复发低风险和高风险组时，低风险患者的PFS明显高于高风险患者[23]。术后ctDNA状态的预后影响与个体临床病理风险特征无关，并且改善了临床病理低和高风险特征的患者的PFS风险估计。有研究还发现，ctDNA突变的增加表示对治疗有抵抗力或即将发生治疗失败[10]。可用来评估化疗后患者的预后。但是ctDNA目前尚未建立这种方法的临床效用，尚无证据表明基于ctDNA检测的治疗可改善预后。尚未确定测定在何种程度上可能具有假阳性检验结果(技术和生物学检验结果)，需要大量的临床实验来为结肠癌进行风险分层。

8 结语与展望

DNA甲基化异常是癌症发展中的早期和频繁事件。不同的癌症患者可能具有不同的甲基化模式，但是每种癌症类型中都有常见的DNA甲基化变化[25]。因组突变的重要性及其在结肠癌的发展和进展中的演变使我们认识到，如果要实现患者治疗的真正个性化，理想情况下需要对原发和转移的序列基因分型。结肠全段的连续活检是不可行的，ctDNA似乎可代表肿瘤的负荷量。目前有证据支持ctDNA可用于发现早期疾病和治疗切除后的微小残留疾病、早期识别复发、评估治疗反应和阐明新出现的耐药机制。越来越多的证据正确地激发了人们对进一步研究ctDNA的热情。ctDNA研究现在已经通过精心设计的大型前瞻性试验得到了发展。ctDNA作为“液体活检”技术，具有简便易行、侵害性小、实时动态佳的优势，且随着科技技术的发展，如PCR等检测技术的提高实现了ctDNA监测的敏感性，且大量的实验已经证明其敏感性高。根据ctDNA所提供的肿瘤相关信息，从而优化治疗方案，满足个体化治疗更加精准的趋势。Ⅱ期结肠癌术后是否辅助治疗存在争议，早期发现残留病灶，准确的预测和评估当前是否需进一步治疗并且及时对治疗方案进行调整是关键。然而，在这个潜在的生物标志物被应用到我们的日常临床实践之前，仍有许多问题需要克服。ctDNA检测仪器及费用较高，并且对实验室及实验人员要求较高，对操作流程要求严格，不同平台之间的可比性较差，且已发表的ctDNA研究使用了不同的样本处理方法，这使得不同研究之间的数据解释和比较变得困难证据力度欠缺仍然是当前很难攻克的难题，使得ctDNA检测技术很难短时间内在临床诊治中推行。因此亟需要大样本、前瞻性的临床研究来证实ctDNA检测对结肠癌患者的临床价值。目前大量的临床实验正在招募，有望评估寻求实用灵敏的靶向标志物，实现结肠癌的精准化、个体化治疗。