m6A修饰调控卵母细胞及早期胚胎发育的研究进展

王领弟综述,杨洪艳审校

0 引 言

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是真核生物最常见和最丰富的RNA表观修饰，m6A修饰存在于很多物种中，占到了RNA碱基甲基化修饰的80%[1]。甲基化酶(METTL3/14/16、WTAP、RBM15、KIAA1429)、去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化识别酶(YTHDF1-3、YTHDC1-3、hnRNP、elF3)是对m6A修饰至关重要的种关键酶，分别发挥着对mRNA甲基化的“编辑”、“消除”和位点“识别”的作用[2]。3种关键酶调控m6A的修饰是一种可逆的过程，影响RNA的代谢过程，比如剪切、核转运、翻译和稳定性，进而影响下游分子机制的发挥，影响生物学功能[2]。

卵子发生、精卵结合及早期胚胎发育在人类生殖活动中至关重要[3]。卵母细胞进行减数分裂形成成熟卵细胞，与精子结合后的合子进行有丝分裂，在植入前发育成囊胚，这些过程中存在活跃的DNA复制、RNA转录与翻译[4-5]，作为mRNA重要的调控因素，m6A在生殖过程中发挥了重要调控作用，本文将综述在卵子及早期胚胎发育过程中m6A调控的相关研究进展。

1 卵母细胞及早期胚胎发育与m6A

1.1 m6A参与卵泡及早期胚胎的发育在出生前，卵原细胞发育形成卵母细胞停留在减数分裂前期。进入青春期后受到激素、信号因子等刺激，生发泡期(GV期)的卵母细胞恢复减数分裂，完成第一次减数分裂，排出第一极体，进入第二次减数分裂并再次停留在第二次减数分裂中期(MII期)。排卵后在输卵管中与精子相遇，恢复完成第二次减数分裂，排出第二极体，形成受精卵，精卵融合成后称为合子[6-7]；合子进入卵裂期，经过细胞增殖分裂，形成囊胚[8- 9]。m6A在细胞增殖过程中调控RNA的剪切、转录、降解等[10-11]，现有不少研究表明，m6A参与了卵母细胞的减数分裂过程，并且在早期胚胎发育过程中也呈现出动态变化，是影响生殖功能的重要因素。

在非洲蟾的卵母细胞中，检测到GV期和MII期的卵母细胞中均存在大量m6A，从GV期发展到MII期，其卵母细胞中m6A总体修饰水平呈现下降的趋势[12]。然而在鸡的卵细胞发育过程中，从卵泡选择前的小黄卵泡到发育至选择后的最小排卵前卵泡，鸡卵内的m6A总体水平是上升的趋势，与之前非洲蟾的研究结果相反[13]。在哺乳动物猪的卵母细胞研究中，发现m6A既存在细胞质中，也存在与细胞核中，但是细胞质中表达水平更丰富，与鸡卵的研究结果类似，猪卵母细胞从GV期发育到MII期，m6A的整体水平是增强的，并伴有METTL3、WTAP和FTO的表达上调。当使用甲基供体干预猪卵母细胞后，可以促进METTL3、METTL14、FTO及m6A水平的表达，但并不促进猪卵母细胞的成熟；而使用甲基化抑制剂则降低猪卵母细胞发育过程中m6A水平，并且阻碍卵母细胞成熟[14]。在小鼠的卵母细胞中，甲基化酶缺乏引起的m6A修饰降低，下调的转录本在3′UTR和终止密码子附近有较高的m6A峰和显著的m6A峰富集，表明m6A修饰较多的转录本表达下降。以上研究均提示m6A修饰可能参与调节卵母细胞的发育过程[15]。

受精后的卵裂和早期胚胎发育，与前期减数分裂紧密相连，m6A修饰持续存在并且呈现动态变化。在果蝇的早期胚胎发育过程中，m6A总体水平被发现有先下降、后升高的波动变化，而在成年后果蝇的检测中，卵巢中的m6A与其他组织相比，处于较高的修饰水平[16]。在斑马鱼的卵巢组织和早期胚胎中，也检测到了m6A的大量表达，以斑马鱼未受精的卵细胞m6A修饰水平为基准，从受精卵到早期胚胎中的m6A水平，表现出先升高、后下降、又回升的趋势[17]。在小鼠中，m6A修饰水平降低的早期胚胎将不能终止其幼稚状态，可能与m6A调控某些关键mRNA的异常表达相关，最终导致胚胎死亡[15]。这些均提示早期胚胎发育与m6A的表达有关。

1.2m6A对卵母细胞成熟以及胚胎发育相关基因及信号通路的调控m6A修饰在mRNA的5′端非翻译区(5′UTR)、编码序列区(CDS)和3′端非翻译区(3′UTR)丰富度较高[18-21]。m6A对减数分裂、细胞增殖的作用，主要是通过调控相关基因、参与某些关键途径来完成的。通过生物信息学分析m6A参与减数分裂和早期胚胎发育的相关通路，提示高甲基化转录本主要参与ErbB通路、孕酮介导的卵母成熟途径、细胞周期途径；低甲基化转录本可能参与RNA降解、DNA复制、核糖体途径、剪接体途径、戊酸磷酸途径、糖酵解-葡萄糖途径[12]。

m6A在鸡卵巢内卵泡的选择过程中发挥作用：在鸡的卵母细胞选择过程前后，转录本的总体数量维持稳定，但是m6A修饰的转录本比例增加[13]；并且在选择前卵泡中m6A在CDS区域更多，而在选择卵泡中，m6A则富集在起始密码子和终止密码子区域更多，并且出现更长的外显子片段，这种差异变化暗示动态变化的m6A可能参与了mRNA的剪切，促进相关转录本形成，进一步影响下游翻译活动，参与调控卵泡的选择过程[1, 13]。通过分析富集基因的功能，发现选择后新出现的m6A富集基因多与“翻译”“mRNA加工”“细胞增殖”等过程相关，而选择后m6A显著下调的基因多与“翻译”“RNA剪切”相关，其中m6A降低的FGF2、FZD1和m6A增加的WNT9a，可能参与Wnt信号通路的调节导致下游信号变化，在卵泡选择过程中起主要作用[13]。

m6A调控相关因子促进卵母细胞成熟及受精后早胚的细胞增殖。在非洲蟾的实验研究中，发现动态变化的m6A修饰调控转录本翻译和细胞分裂过程：Cyclin B2是一种重要的细胞周期蛋白，在减数分裂中起重要作用，是纺锤体形成过程中必不可少的[22]，Mos蛋白可能在MII期促进减数分裂的恢复[23]。在非洲蟾卵母细胞中，Cyclin B2和Mos的mRNA 3′UTR区m6A富集降低，3′UTR元件介导翻译激活，使得其翻译效率升高，m6A通过调节Cyclin B2及Mos的表达参与减数分裂活动，进而影响卵母细胞的发育[12]。此外，Cdt1的mRNA于CDS区的m6A修饰降低，可以促进有丝分裂DNA的复制，有利于细胞增殖以促进早期胚胎的发育[12]。另外，在猪的研究中表明，猪卵母细胞发育m6A相关基因有CDK1、ERK1、ERK2和Lin28[14]。CDK1作为MPF成熟促进因子，一方面可以促进染色体浓缩、核膜消失[22]，另一方面可以调节纺锤体形成和MII期停滞，是减数分裂中调节卵母细胞成熟的关键信号[24]；MAPK家族重要成员ERK1和ERK2，可以被磷酸化激活，激活后的ERK1/2通过调控下游因子促进微管蛋白形成纺锤体[24]。在猪卵内的m6A水平下降，下调了CDK1和ERK1/2表达，改变了MII期MPF及MAPK这两条关键通路传导，引发纺锤体形成和染色体分离障碍，最终表现为卵母细胞成熟阻滞[14]。Lin28是高度保守的RNA结合蛋白，通过结合let-7家族microRNA前体或直接与mRNA结合，调控其翻译和稳定性，参与细胞多能性、葡萄糖代谢、配子发生等多个过程[25]，m6A下调Lin28表达量也减少，影响猪卵发育及后续的卵裂和胚泡发育形成[14]。

2 m6A相关酶的缺乏对卵泡发育及早期胚胎发育的影响

目前被广泛认知的甲基化转移酶有METTL3/14/16、KIAA1429、WTAP等，去甲基化酶为FTO和ALKBH5，甲基化识别酶有YTHDF1/2/3和YTHDC1/2/3等。甲基化转移酶上调m6A，去甲基化酶则下调m6A水平，这两类酶在细胞核内发挥相反的作用[26]，也是m6A能够动态调控卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育的关键。甲基化识别酶定位甲基化的位点，有促进mRNA稳定性、翻译、降解、剪切、加工、出核等功能[27]。以上m6A相关酶共同调控卵泡及早期胚胎发育，任何一种酶的缺失都可能引起发育障碍。

2.1甲基化酶和去甲基化酶敲除的影响METTL3敲除影响斑马鱼卵母细胞的发育。在斑马鱼体内条件性敲除METTL3后，与野生型比较，雌性突变体卵巢内生发泡破裂发生率降低，成熟卵泡的数量显著减少，导致产卵量大幅下降，甚至影响到产子后代雌雄比例，使得雄性比例上升[17]。这可能是因为METTL3缺失引起m6A在LHβ、NPR、IGF3、Star、3β-HSD和CYP19A1等基因上修饰不足，以及11-酮基睾酮和雌二醇的浓度下降，影响了促性腺激素和雌激素合成信号途径，导致突变体的卵母细胞发育受阻[17]。

KIAA1429特异性敲除导致小鼠卵母细胞发育停滞。在小鼠卵母细胞中特异性敲除KIAA1429后，卵巢表现出体积的缩小、GVBD率降低、MII期卵母细胞缺乏、第一极体排除率降低、次级卵母细胞数量减少、颗粒细胞的数量减少等，可能与KIAA1429通过调控剪切因子SRSF3参与卵母细胞发育相关mRNA的选择性剪切相关[15]。SRSF介导的PDLIM7外显子包涵体已经被证明对小鼠卵母细胞减数分裂中维持适当的GVBD至关重要[28]。并且KIAA1429与SRSF3和YTHDC1在促进外显子增加方面有类似的作用趋势[15]。

METTL3的敲除对于小鼠胚胎具有致死性。METTL3基因敲除小鼠，其植入前的外胚层细胞和幼稚胚胎干细胞在mRNAs中缺失m6A，m6A修饰影响mRNA的稳定性，包括关键的促进多能干转录本的稳定性，以致胚胎的幼稚状态不能被终止；Mettl3在体内调节多潜能启动和分化，纯合缺失突变影响胚胎多能性及分化，胚胎着床后发生异常的族系启动，最终引发胚胎死亡[29]。

在METTL16条件性敲除的小鼠杂交后代中，无法得到纯合缺失的METTL16-/-小鼠，表明了METTL16缺失具有潜在胚胎致死性。研究在E2.5和E3.5期观察到了所有基因型的早期胚胎，但是在E8.5和植入后的胚胎中完全没有纯合缺失的基因型，表明敲除METTL16后可以使胚胎发育到囊胚期，但是在着床前后发育停滞[30]。其机制与METTL16的缺失导致编码SAM(SAM是细胞中甲基化的重要供体)合成酶的MAT2A mRNA下调有关[31]。

WTAP基因敲除的小鼠也具有胚胎致死性。WTAP突变体胚胎在E7.5期虽然可以形成胚外组织和内脏前胚层，但不能分化为内胚层和中胚层，胚胎发育停滞，最终死亡[32]。WTAP被认为在选择性剪接、mRNA稳定等方面发挥作用[32-33]。

颗粒细胞与卵母细胞发育相互促进，在人的卵巢颗粒细胞中分别使去甲基化酶FTO和ALKBH5基因沉默，结果提示FTO或ALKBH5的缺乏都会引起m6A水平上升，但FTO缺失会引起细胞增殖相关因子和激素相关因子如FOXL2、CYP191A、FSHR和AMH的表达量下降，使得颗粒细胞的细胞凋亡增多，进而抑制了卵母细胞发育及卵泡的成熟[34]。

2.2甲基化识别酶敲除的影响YTHDC1在卵母细胞及后续胚胎发育发挥重要作用。YTHDC1在卵母细胞的GV期表达量少，在MII期表达量显著增加，YTHDC1与MII期之后的母体转录本活跃有关[35]。而在雌性小鼠中条件性敲除YTHDC1，发现YTHDC1的缺乏会引起3′UTR端广泛的多聚腺苷酸化(APA)，APA是一种转录后调控手段，可以调节3′UTR的长度来影响mRNA的剪切及稳定性，YTHDC1敲除的小鼠卵母细胞内发生广泛的mRNA剪切缺陷，延长的3′UTR引起局部剪切变异，在细胞质内出现异常的mRNA积聚颗粒，影响卵母细胞发育[35]。此外，YTHDC1是唯一位于细胞核内的m6A识别酶，YTHDC1缺失抑制了与SRSF6的相互作用，阻碍了SRSF3、SRSF7与NXF1的结合，使得前体RNA的加工和出核受阻，进而影响下游转录本的翻译[35]。

YTHDC2在卵泡发育减数分裂中必不可少。研究表明，YTHDC2条件性敲除小鼠卵巢内缺乏发育中的卵泡，缺乏DDX4生殖细胞标记，在小鼠胚胎发育的第14.5-15.5天时，YTHDC2突变体小鼠胚胎卵巢内卵原细胞并没有像野生型一样如期进入减数分裂期，仅能检测到较少的减数分裂前期Sycp3标记并仅出现减数分裂前期征象，表现出异常的染色质浓缩[36]。此外，突变体卵巢内生殖细胞不仅没有进入减数分裂期，而且有丝分裂标记物CyclinD1和pH3持续表达，表明缺乏YTHDC2可能是在进入减数分裂的前期发挥调控作用[36]。另有研究表明YTHDC2是与MEIOC结合形成复合物一起发挥促进减数分裂作用的，认为MEIOC是YTHDC2必不可少的伴侣蛋白[37]。

YTHDF2在早期胚胎发育中清除母源RNA方面发挥重要作用。YTHDF2在卵母细胞减数分裂的影响较小，但是引起mRNA 3′UTR区的m6A修饰转录本的上调，从而促进母本mRNA的清除[38]。条件性敲除YTHDF2后的小鼠，虽然纯合缺失的雌性小鼠有排卵发生，但是能够发育到2个细胞期的合子数量减少[38]。YTHDF2敲除后在MII期无法识别靠近3′UTR端的m6A修饰，转录本数量下降，使得mRNA发生异常清除，从而影响到卵细胞的质量，卵子质量的改变进一步影响精卵结合后合子期的发育[38]。在斑马鱼敲除实验研究中，证明斑马鱼早期胚胎中超过三分之一的母源mRNA上存在m6A修饰，这些mRNA之后会被YTHDF2调控清除，所以YTHDF2被敲除后，带有m6A修饰的母源mRNA清除受阻，进而影响合子基因组的激活，使得这些胚胎无法及时开启从母体向合子期的过渡，细胞周期发生中止，停在G2晚期或M早期，从而导致斑马鱼子代发育延缓[39]。并且应用MO阻断剂阻断YTHDF2功能的验证，与YTHDF2敲除的结果一致[39]。此外，有研究显示YTHDF3也可能通过与YTHDF2合作加速m6A mRNA的降解[40]。

3 m6A及相关酶与女性卵巢衰老的关系

上述研究提示m6A及其相关酶的变化在女性卵母细胞发育中发挥了重要作用，卵巢颗粒细胞(Granulosa cells，hGCs)是伴随卵母细胞发生并且发挥促进卵泡发育作用的一类细胞，二者构成卵泡的主体，维持着卵巢功能。研究收集早发性卵巢功能不全(POI)不孕症患者hGCs，并获取与输卵管不通不孕症患者的hGCs与之对照，分别检测m6A水平，发现POI患者hGCs内m6A水平升高，并且FTO下调，ALKBH5无显著变化。通过基因沉默分别检验去甲基化酶FTO和ALKBH5沉默后对卵巢颗粒细胞的影响，发现FTO沉默后hGCs的m6A水平升高，而沉默ALKBH5则无明显影响[34]。应用环磷酸酰胺(CTX)建立的卵巢早衰小鼠模型实验中，CTX抑制了卵巢内FTO、YTHDC1和YTHDF1-3的表达，促进了METTL3、METTL14、KIAA1429的表达，卵巢内m6A水平总体升高。进一步研究证明了化疗药物环磷酰胺(CTX)干预hGCs是一种行之有效的POI体外细胞模型，与正常hGCs相比，模型组m6A升高，与甲基化酶METTL3/14、KIAA1429上调、去甲基化酶FTO下调、甲基化识别酶YTHDF1/2/3及YTHDC1下调有关，与WTAP、RBM15、ALKBH5等酶无明显相关[41]。CTX对甲基化识别酶的下调可能干扰了mRNA的剪切与出核运动，使得卵巢生殖细胞的发育受阻[41]。

总之，m6A甲基化转移酶的上升、FTO的减少共同影响m6A修饰水平，影响卵巢功能。分析其原因，可能是m6A通过影响卵母细胞成熟相关因子的转录，并且下调甲基化识别酶表达影响mRNAs转录后加工与出核运动，多途径阻碍了卵母细胞及卵巢颗粒细胞的成熟和增殖，使得卵巢功能下降，最终导致不孕[34, 41]。

4 结 语

m6A的研究正在逐渐被报道，关于甲基化酶、去甲基化酶和甲基化识别酶三类关键的酶蛋白在m6A修饰中作用机制的研究探索日渐丰富，对于m6A机制本身的研究挖掘也不断在更新中。对于编辑器、擦除器和读码器的功能继续研究，将会进一步揭示m6A修饰的发生与维持机制。异常的m6A甲基化程度，包括m6A RNA甲基化酶识别酶、甲基化酶和去甲基化酶的缺失，可导致RNA的失效和各种疾病[42]。虽然关于m6A在生殖领域的研究还较少，且当前研究结果存在争议与矛盾点[42]，但综合现有研究证据都提示了m6A在卵子发育和早期胚胎发育过程中发挥重要作用，具体的影响机制还亟待进一步研究。此外，m6A的测定技术也在不断发展中，新技术升级改进对m6A领域的研究进展起到重要影响。随着对m6A修饰的各方面研究逐渐增加，有望针对m6A修饰的研究挖掘出更多的规律，为生殖领域的研究带来新的思路。