间充质干细胞治疗炎性疾病的研究进展

袁福临，张 毅

（军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是具有低免疫原性和强大免疫调节能力的成体干细胞，可从脂肪、骨髓、脐带、牙髓和围生期胎盘等多种组织分离获得。基于独特的免疫调节特性，MSC具有广阔的临床应用前景，尤其是对炎性疾病的治疗。炎性疾病是由长期的免疫调节功能紊乱或长期服用免疫抑制剂导致人体内免疫抑制功能逐渐被破坏所致的疾病。具有免疫调节特性的MSC作为免疫抑制剂的理想替代物，可有效治疗炎性疾病。本文就MSC在治疗炎性疾病中的研究进展予以综述。

1 MSC的免疫调节作用

MSC的免疫调节作用依赖免疫调节介质，如趋化因子、细胞因子、生长因子、色氨酸分解代谢酶吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等。在促炎因子的刺激下，MSC分泌免疫调节介质，抑制T细胞的活性和增殖。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肝细胞生长因子、白血病抑制因子、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、肿瘤坏死因子刺激基因6蛋白、血红素加氧酶1、半乳糖凝集素和外泌体均可抑制辅助性T细胞1（T helper 1，Th1）、Th17、M1型巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞等促炎免疫细胞的增殖和功能，促进M2型巨噬细胞、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）、调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）等抗炎免疫细胞增加［1］。抗炎免疫细胞又可进一步抑制促炎免疫细胞的活性和功能，进而促进损伤组织的修复。TGF-β是MSC诱导Treg和抑制淋巴细胞活化的关键［2］。有研究表明，骨髓源性MSC（bone marrow derived MSC，BM-MSC）中IL-6的缺失可有效减弱BM-MSC支持T细胞存活的作用［3］。MSC 产生的趋化因子配体 2（CC-chemokine ligand 2，CCL2）可调节T细胞的免疫检查点程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）的表达，同时，可抑制Th17细胞的功能［4］。另外，MSC分泌的趋化因子可将T细胞招募至MSC周围，进而使MSC产生iNOS和IDO，抑制T细胞的活性和增殖，影响炎症的发生发展过程［1］。NOS有3种同工酶亚型，神经元型NOS、内皮型NOS和iNOS［5］。MSC通过NO抑制狼疮易感小鼠的滤泡辅助性T细胞（follicular Th，Tfh）的增殖，iNOS是这一过程中的重要介质。iNOS催化产生的NO通过影响Janus激酶信号转导和转录激活因子信号通路致T细胞周期停滞［2］。除直接抑制T细胞增殖外，NO的增加还可调节丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB的活性，干扰巨噬细胞产生促炎性细胞因子。另外，MSC表达的IDO通过诱导单核细胞分化为M2型巨噬细胞来调节先天免疫活性，从而减轻炎症［6］。IDO发挥免疫抑制作用的具体机制目前尚不清楚，有一种可能是由于色氨酸的分解代谢，导致其水平降低，从而影响免疫细胞的存活。

2 MSC在治疗炎性疾病中的应用

由于其强大的免疫抑制作用，MSC在治疗炎性疾病中具有广阔的临床应用前景，并在临床试验和临床前研究中得到广泛关注。目前，全球MSC临床注册项目已达约1000项［7］。

2.1 移植物抗宿主病

移植物抗宿主病（graft versus host disease，GvHD）是异基因造血干细胞移植后的主要并发症，由供者T细胞攻击受者同种异型抗原所致，是移植致死的主要原因之一。许多研究表明，MSC可抑制T细胞增殖，尤其是抑制Th1和Th17亚群的分化，促进Treg的生成。但只有当微环境出现高浓度的炎症因子时，MSC才发挥免疫抑制功能，如当炎症细胞因子IL-17存在时，MSC介导的免疫抑制在体外和体内均可进一步增强［8］。实验研究表明，类固醇通过下调MSC中IDO和iNOS的表达而抑制MSC的免疫抑制能力。因此，MSC联合类固醇治疗效果弱于单独用MSC。同样，在心脏移植大鼠模型中，低剂量环孢素可削弱MSC的免疫抑制作用［9］。另外，使用经干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）预处理的MSC可显著提高GvHD小鼠的存活率［10］。由此说明，炎性微环境对MSC发挥免疫抑制作用至关重要。因此，传统的临床抗炎治疗方法由于改变了炎性微环境而不利于MSC发挥作用。有研究发现，随着CD5+B细胞产生IL-10的增加，慢性移植物抗宿主病（chronic GvHD，cGvHD）患者的临床症状得到改善［11］。经MSC治疗后，cGvHD患者CD5+B细胞又可使IL-10表达显著增加，但IL-10又可阻断MSC的免疫抑制功能［11］，提示MSC在体内发挥免疫调节作用的复杂性。

另外，MSC外泌体（mesenchymal stem cell exosome，MSC-Exo）对参与cGvHD发病机制的自身反应性T细胞的活化和迁移具有抑制作用。MSC-Exo可能通过抑制致病性Th17细胞进入靶器官而显著降低Th17细胞的数量，同时促进Treg的生成，进而减轻cGvHD的症状［12］。有研究表明，凋亡的MSC通过诱导受体吞噬细胞产生IDO的水平升高，从而在GvHD小鼠模型中发挥免疫抑制作用；经腹腔注射凋亡的MSC后，小鼠的GvHD症状得到缓解；但经静脉注射相同量的凋亡MSC后，GvHD症状却无明显改善［13］。因此，不同的注射途径对MSC治疗作用的影响仍值得研究和关注。此外，有实验研究表明，低氧和钙离子诱导的小MSC（small MSC primed with hypoxia and calcium ions，SHC-MSC）比大且扁平的MSC表现出更强的免疫调节功能［14］。分析发现，SHC-MSC中的polo-样激酶 1（polo-like kinase-1，PLK1）表达上调。在人源化小鼠模型中，与注射单纯的MSC的小鼠相比，PLK1过表达的MSC可显著提高GvHD小鼠的生存率，并减轻GvHD小鼠靶器官的组织病理学损伤，表明SHC-MSC对GvHD治疗的有效性。一项Ⅱ期临床研究结果显示，对55例类固醇耐药的严重GvHD患者使用MSC，其中30例完全缓解，9例好转（总缓解率为70%）［15］。由此可见，MSC的应用治疗还有很多亟待解决的问题，如不同的注射方式对治疗效果的影响和MSC在体内参与免疫调节的机制等，需要深入探讨。

2.2 类风湿性关节炎

免疫紊乱是类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要发病机制，其由活化的CD4+T细胞和MHC-Ⅱ型阳性的抗原递呈细胞浸润关节滑膜所致。主要表现为关节滑膜的血管增生和炎症细胞浸润，临床对于该病主要以抗炎药物、抗风湿药物和糖皮质激素治疗为主，但对人体会产生很大的不良反应，且只能暂时控制患者的疼痛症状，并不能遏制病情的进展。此外，在治疗的后期，很多患者表现出对药物的耐受。因此，具有抑制T细胞增殖和产生抗炎作用的MSC受到关注。MSC是Th1和Th17细胞增殖的有效抑制剂，并能显著降低其产生促炎因子IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-17和IL-22的能力。RA的发病机制与Th17和Treg细胞之间的失衡密切相关，二者的分化途径相近，但功能完全相反［16］。已有报道，在RA患者的滑液中发现高水平的IL-17，表明Th17与疾病的严重程度呈正相关［17］。RA患者关节液中Treg细胞较为丰富，但炎症仍然存在，表明Treg细胞的功能在RA患者体内可能已发生变化。从活动期RA患者中分离的Treg细胞对效应T细胞释放的促炎因子如IFN-γ和TNF-α的分泌无抑制作用［17］。TNF-α可抑制Treg的抑制功能，说明RA患者关节液中富含的Treg细胞可能已转化为促炎的Th17细胞，而不能发挥免疫调节功能。研究表明，MSC与纯化的CD4+T细胞共培养后，以接触依赖的方式诱导CD4+T细胞表面的CD25和FoxP3表达。CD4+CD25+FoxP3+Treg的产生部分依赖于MSC表面诱导型共刺激分子配体（inducible co-stimulator ligand）的表达［16］。共刺激分子表达在激活的记忆T细胞上，包括Th17细胞，因此通过细胞接触机制，MSC可能与记忆Th17细胞相互作用并产生记忆Treg细胞。因此，MSC移植治疗RA的潜在机制可能是MSC通过纠正失衡的Th17/Treg水平，从而恢复了机体免疫平衡。除此之外，RA患者关节液中存在大量γδT细胞，这些细胞分泌IFN-γ，IL-2和IL-17等炎症因子。MSC可抑制γδT细胞的增殖与细胞溶解反应，同时，MSC通过释放PGE2作用于γδT细胞上的PGE受体2和4，从而抑制细胞因子的产生［17］。众所周知，Tfh细胞辅助B细胞的增殖和抗体的产生。研究发现，从RA患者体内分离的CD4+T细胞向Tfh细胞分化时，可被由IFN-γ刺激后的人脐带来源的MSC（human umbilical cord derived MSC，hUC-MSC）产生的IDO所抑制［18］。另外，MSC还可抑制Tfh细胞向Tfh1，Tfh2和Tfh17的分化，从而降低自身反应性B细胞的数量和自身抗体的产生［18］。由此可见，MSC对T细胞的抑制作用是多方面的。

除MSC移植外，MSC来源的胞外囊泡（MSC-derived extracellular vesicles，MSC-EV）也能发挥免疫调节功能。MSC-EV有2种形式，分别是直径≤150 nm的外泌体（exosomes，Exo）和直径在150～1000 nm的微粒（microparticles，MP）［19］。研究表明，MSC来源的MP和Exo发挥免疫抑制功能的方式类似，都是通过减少T细胞和B细胞增殖以及诱导Treg细胞发挥免疫调节作用。在抑制关节炎症方面，Exo比同等数量的Mp更有效，但总EV对关节炎有更全面的保护作用［20］。

成纤维细胞样滑膜细胞的增生和分泌是造成RA的主要病因，有研究报道，与人MSC-EV相比，人MSC来源的过表达miR-124a的外泌体（miR-124a over expressing human MSC-derived exosomes，hMSC-124a-Exo）与RA相关成纤维细胞样滑膜细胞系（MH7A细胞）共培养时，能更加显著地抑制MH7A细胞增殖和体外迁移；miR-124a还促进MH7A细胞的凋亡［21］。因此，hMSC-124a-Exo为RA的治疗提供了新的希望。研究表明，输注脂肪来源的MSC（adipose-derived MSC，ADMSC）后，小鼠RA严重程度显著下降，并伴随脾和外周血致病性GM-CSF+CD4+T细胞数量减少；在淋巴结中，Treg不同亚群，如FoxP3+CD4+T细胞和IL-10+IL-17-CD4+T细胞的数量增加［22］。此外，研究显示，牙龈组织来源的MSC可显著降低关节炎病理评分的严重程度，下调促炎因子IFN-γ和IL-17A的产生，导致CD4+CD39+FoxP3+Treg的增加［23］。总之，尽管各种组织来源的MSC在治疗RA中显示出良好的应用前景，但其作用的机制和临床应用的标准尚需进一步研究。

2.3 糖尿病

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌和（或）胰岛素作用缺陷引起的疾病，主要分4型：1型糖尿病（type 1 DM，T1DM）、T2DM、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病。T1DM属于自身免疫性疾病，患者缺乏自身免疫耐受，胰腺β细胞受到免疫系统攻击破坏。T2DM表现为胰岛素分泌不足或靶细胞对胰岛素不敏感。研究表明，MSC可促进胰岛功能的恢复和胰岛β细胞的增加，通过降低胱天蛋白酶3活性并减少胰岛β细胞凋亡，从而修复胰岛细胞。同时，旁分泌血管生成因子如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子和血管性血友病因子的释放可促进胰岛血管化，进而参与细胞再生。MSC还具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能［24］。

Treg细胞可抑制免疫系统，防止过度激活和自身免疫损伤。有研究表明，应用与hUC-MSC共培养的CD4+CD62L+Treg治疗非肥胖糖尿病小鼠可显著减轻自发性自身免疫性胰腺炎，恢复血中Th1/Th2细胞因子平衡，并诱导浸润胰岛的白细胞凋亡［25］。因此，Treg细胞对T1DM的病情缓解有重要作用。迄今为止，只在DM动物模型中观察到MSC对胰岛β细胞的保护作用，因此尚需深入探讨其在人体内是否对胰岛β细胞产生保护作用。另外，MSC对T2DM治疗作用的研究表明，MSC输注可显著提高机体对胰岛素的敏感性，胰岛素靶组织中磷酸化胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate，IRS-1）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和葡糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）均有所升高，而胰岛素抵抗的发生可能与这些蛋白的表达缺陷有关［24］。研究表明，AD-MSC可通过促进肝糖原的合成，抑制肝葡糖生成，调节肝葡糖的新陈代谢［26］。同时，AD-MSC通过激活IRS/Akt/GLUT4途径和减轻先天免疫反应和获得性免疫反应，改善脂肪、肌组织和肝等器官的胰岛素抵抗作用。有研究显示，人脐带沃顿胶（Wharton jelly）来源的MSC不仅可提高对糖代谢的控制和β细胞的功能，还可减少炎症因子和T细胞的数量［27］。BM-MSC移植后，在DM小鼠中发现显著的β细胞再生，但再生的胰岛β细胞中检测到只有1.7%～3.0%来自骨髓［28］，表明这些β细胞的生成还有另外的途径。此外，MSC在治疗DM方面，还未达到临床上的大规模生产胰腺前体细胞或β细胞的水平。

另外，外源性胰岛素的作用只是部分降低并发症的风险，并不如内源性胰岛素的作用精确。目前胰岛移植作为临床重建内源性胰岛素分泌的主要手段，其联合MSC治疗可有效降低胰岛移植物的炎症和排斥反应［29］。同时，MSC介导的血运重建通过缩短移植后缺血期也有助于胰岛移植物存活［30］。

DM患者长期的代谢紊乱导致体内自由基水平急剧增加，引起细胞损伤，削弱免疫系统功能。因此，DM患者常有并发症发生，如糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变和神经系统并发症等。糖尿病肾病主要是由高糖引起的线粒体功能障碍引起，MSC通过多种机制保护受损的肾或移植肾，如通过促进肾细胞存活，减少上皮细胞凋亡，抑制异常免疫反应和重塑细胞外基质。最近一项研究表明，BMMSC线粒体移植在结构和功能上对糖尿病肾病中的肾近端小管上皮细胞有修复作用。体内实验表明，分离的线粒体移植可改善链脲佐菌素导致的肾近端小管上皮细胞损伤的管状基底膜及刷状缘结构［30］。白藜芦醇（resveratrol，RSV）是在葡萄和红葡萄酒中发现的一种天然多酚，基于其强大的抗DM、抗氧化和抗炎特性，有研究将RSV与MSC结合治疗DM神经病变。小鼠模型实验结果表明，MSC联合RSV组小鼠血糖和C肽水平较其他DM组有明显改善，轴突直径、有髓神经纤维数量和髓鞘深度、神经生长因子、髓鞘碱性蛋白和NF-κB水平显著高于MSC组和RSV组，因此RSV联合MSC在降低高血糖和改善DM神经病变方面具有显著疗效［31］。总之，MSC对DM的治疗具有极大的开发潜力，但其作用机制和治疗方案尚需进一步研究。

2.4 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多系统损害的免疫系统疾病，因为T和B细胞的大量活化，B细胞产生的大量的自身抗体与自身抗原结合形成免疫复合物，从而导致大量组织损伤。目前急性期的主要治疗方案为肾上腺皮质激素加免疫抑制剂，但面对病情危重或治疗困难病例时，细胞治疗发挥重要作用，MSC是治疗SLE的首选细胞。研究结果表明，大部分难治性SLE患者在移植来自健康的非自身免疫性个体的同种异体BM-MSC后，临床症状获得缓解。在SLE患者中，IL-1β和TNF-α刺激的BM-MSC产生促炎作用，促进T细胞增殖和Th效应细胞亚群分化，而未经TNF-α和IL-1β刺激的BM-MSC表现抗炎免疫调节功能［32］。IDO主要由树突状细胞和巨噬细胞分泌，是一种介导色氨酸降解为免疫抑制代谢物的酶。IDO在同种异体BM-MSC介导的抑制SLE患者T细胞增殖中起着不可或缺的作用，IFN-γ可以增强这种作用［33］。然而，活动期SLE患者的BM-MSC在IFN-γ刺激下IDO却产生不足［33］。另外，hUC-MSC介导的抑制SLE患者T细胞增殖中，抗TGF-β抗体的使用可抑制Treg细胞数量，PGE2抑制剂的使用可显著抑制Th17细胞数量的减少，但IDO抑制剂对Treg和Th17细胞无影响［34］。由此可见，不同来源的MSC发挥不同的免疫调节机制。

Tfh细胞的主要功能是辅助B细胞增殖和产生抗体，MSC可通过产生NO抑制狼疮易感小鼠的Tfh细胞增殖。iNOS在体内是合成NO的重要限速酶，iNOS的特异性抑制剂L-单甲基精氨酸在体外可部分恢复被MSC抑制的Tfh细胞的增殖［35］。因此，保证NO的生成量和iNOS的稳定将更有助于提高MSC治疗的临床效果的稳定性。有实验证明，MSC促进Breg的增殖和IL-10的分泌，Breg可能对CD4+T细胞的增殖及其IFN-γ的分泌有明显的抑制作用［11］。另外，MSC也可抑制B细胞向浆细胞分化，减少免疫球蛋白的产生，下调细胞表面趋化因子受体的表达［11］。

最新研究结果表明，SLE患者的MSC形态和功能均发生异常改变。与正常对照组相比，SLE患者的BM-MSC生长缓慢，更易发生凋亡和衰老，分泌细胞因子的水平也降低，抑制T细胞和B细胞增殖分化的功能亦存在缺陷［37］。一项研究表明，由于趋化因子2水平降低，狼疮样小鼠和SLE患者的BM-MSC抑制正常B细胞的增殖和分化功能受损［36］。另外，SLE患者的BM-MSC在体外的增殖潜力非常有限，纤维状肌动蛋白细胞骨架异常，细胞内活性氧和线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）水平升高，并呈现出体积膨胀、核仁深染和细胞衰老现象［37］。有研究表明，SLE患者BM-MSC的促炎和衰老表型由MAVS介导，MAVS沉默可下调IFN-β，P53和P16蛋白表达，且能改变细胞因子的产生［37］。这一新发现的途径可能为SLE自身免疫的细胞机制提供重要的见解。

有研究显示，在SLE患者BM-MSC中，miR-663通过抑制TGF-β1的产生，进而诱导Tfh细胞数量减少和Treg细胞数量增加，从而调节患者体内的免疫功能状态。miR-663的过表达削弱了BM-MSC的治疗作用；当抑制miR-663表达时，小鼠的SLE症状则得以缓解［38］。因此，miR-663是SLE患者BM-MSC调控的关键介质，可能成为狼疮治疗的新的治疗靶点。由于SLE患者体内的MSC呈现明显的衰老特征，有研究结果表明，SLE患者血清中的瘦素和中性粒细胞激活肽可促进MSC的衰老［39］；也有研究显示，瘦素可促进自身反应性T细胞的增殖并抑制其凋亡［40］。因此，减少SLE患者血清中的瘦素和中性粒细胞激活肽将成为患者病情调节的一项重要手段。一项多中心临床研究表明，在12个月的随访期间，32.5%患者达到完全临床缓解，27.5%患者达到部分临床缓解，17.5%患者在移植后6个月疾病复发并再次进行MSC移植［41］。因此，为获得更好的临床疗效并为临床治疗提供更有力的依据，对MSC的免疫调控作用机制的深入认识仍有待完善。

3 结语

由于对MSC作用机制的了解尚不完全，关于MSC对炎性疾病的治疗和作用机制仍需深入探讨，一些问题仍亟待解决。如在某些情况下，MSC分泌的细胞因子可增强免疫反应。在结肠炎的小鼠模型中，T细胞是导致疾病复发的关键因素，而MSC释放的IL-7对支持记忆T细胞的生存至关重要。因此，MSC的免疫抑制和促炎特性可能部分是由MSC分泌的细胞因子所介导，如何调整这些因素用于调节MSC的免疫作用仍需进一步的研究。另外，凋亡的MSC也可发挥免疫抑制作用，未来是否有必要增加MSC移植后的体内生存能力或者与直接输注凋亡的MSC用于治疗相比，2种疗法的疗效对比等仍需深入探讨。此外，如何准确结合患者自身情况，精确把握MSC的注射剂量；不同来源的MSC的疗效对比等也是临床应用前需考虑的因素。目前很多临床研究属于小样本试验，观察期短，缺乏长期安全性的可信度，还需要进一步扩大临床研究的样本量。但大量实验研究已证明MSC治疗炎性疾病的有效性，有理由相信MSC治疗炎性疾病终将成为一种安全且高效治疗方法。