一种体外多终点遗传毒性检测方法

黄鹏程，王敬亭，3，赵田田，，赵泽浩，，周长慧，，李若婉，朱春梅，郑 阳，常 艳，

（1.上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203；2.中国医药工业研究总院，上海 201201；3.复旦大学药学院，上海 201203）

在真核细胞的生长过程中，DNA会因各种内在或外来因素如X射线、环境污染物和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等发生损伤。在这些损伤中，DNA双链断裂是最为严重的损伤之一［1］。在形成DNA双链断裂数秒钟后，断裂处的组蛋白H2AX被磷酸化。磷酸化后的H2AX被称为γ-H2AX［1］。研究发现，γ-H2AX灶点数与DNA双链断裂数成对应关系。因此，对γ-H2AX灶点数的定量检测可反映DNA双链断裂损伤的程度［2］，是检测DNA双链断裂较为敏感的生物标志物之一［3］。目前γ-H2AX灶点检测已具备快速、准确和可高内涵分析的能力，但仍存在检测指标单一、假阳性率较高、需添加体外代谢活化系统和受细胞凋亡影响较大的局限［4］。

近年来，基于多色流式细胞术的多终点遗传毒性检测法，可将多个遗传毒性终点生物标志物的检测整合进γ-H2AX灶点检测，提高检测效率，降低检测假阳性率，还可以提供化合物作用机制等更多信息［6］，成为克服当前γ-H2AX灶点检测缺点的重要方法。

生物标志物P53蛋白、磷酸化组蛋白H3（p-H3）和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）可用于检测不同的遗传毒性终点。P53蛋白是一种调控细胞周期的转录因子，可以提供DNA损伤修复信息；p-H3可以作为非整倍体效应的生物标志物［5］；活化PARP是胱天蛋白酶的切割底物，可以标记胱天蛋白酶高表达的细胞。将这几种生物标志物整合到γ-H2AX灶点试验中，不但可以增加试验准确性，还可以排除胱天蛋白酶诱导的γ-H2AX灶点，降低试验假阳性率［6］。

本研究以经典的致断裂剂依托泊苷、环磷酰胺和非整倍体诱导剂秋水仙素为阳性对照品，以p53基因完整的人成淋巴TK6细胞为试验体系，建立基于多色流式细胞术的多终点组合检测遗传毒性的评价方法。最后采用DNA断裂剂丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、苯并芘和顺铂，非整倍体诱导剂长春新碱和紫杉醇，不具有遗传毒性的化合物氯化钠、氨苄青霉素G和盐酸普萘洛尔对该方法的灵敏度和特异性进行验证。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

人成淋巴TK6细胞（美国模式培养物集存库），细胞复苏后在含10%马血清和L-谷氨酰胺4 mmol·L-1的RPMI 1640完全培养基中，在37℃，5% CO2的加湿条件下悬浮培养。每周传代2～3次，细胞密度维持在（2～10）×108L-1。依托泊苷、环磷酰胺、秋水仙碱、丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、长春新碱、紫杉醇、苯并芘、顺铂、氯化钠、氨苄青霉素G、盐酸普萘洛尔和RNA酶（Sigma公司，美国）；RPMI-1640培养基、L-谷氨酰胺和热灭活马血清（Gibco公司，美国）；CCK-8试剂盒（同仁公司，日本）；细胞通透/洗涤缓冲液、Alexa Fluor®647 小鼠抗人H2AX（pS139）（货号：560447）、PE小鼠抗人P53 Se（tRUO）（货号：557027）、FITC标记小鼠抗人活化PARP（Asp214）单克隆F21-852抗体（货号：558576）、Alexa Fluor®647大鼠抗小鼠p-H3（pS28）单克隆 HTA28（RUO）抗体（货号：558217）和7-AAD染液（货号：559925）（BD公司，美国）；大鼠肝S9（Moltox公司，美国）；6 μm计数微珠（赛默飞世尔，美国）；辅助因子为本实验室自制；U型底96孔板（康宁公司，美国）；Accuri™C6流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.2 受试物溶液和代谢活化系统

二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和无菌去离子水为受试物和阳性对照药配制溶剂，并设为同组溶剂（阴性）对照（表1）。体外代谢活化系统是大鼠肝S9和辅助因子的混合物，大鼠肝S9在培养基中的终浓度为0.75%（V/V），临用前新鲜配制并保存在湿冰上。

Tab.1 Test article information and concentration selection

1.3 体外多终点遗传毒性检测方法的建立

1.3.1 细胞处理

取对数期生长的TK6细胞，按3×108L-1密度接种在U型底96孔板中，每孔接种细胞数约为6×104。未加 S9（-S9）组加入终浓度为 0.2，0.4，0.8和1.6 mg·L-1的依托泊苷或0.0063，0.0125，0.025和0.05 mg·L-1的秋水仙素含药培养基，处理24 h；加入S9（+S9）组加入含0.75% S9及终浓度分别为3.75，7.5，15和30 mg·L-1的环磷酰胺培养基处理4 h；随后更换为不含药完全培养基继续培养24 h；随后进行下一步处理。每浓度设2复孔。

1.3.2 细胞收获、固定和洗涤

将含待收获细胞的96孔板离心，用200 μL PBS洗涤2次后离心（200×g，6 min）弃上清，缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇重悬，-20℃固定过夜（约16 h，至少4 h）。固定后离心（400×g，6 min），每孔使用约200 μL PBS洗涤细胞2次，离心（400×g，6 min）弃上清。

1.3.3 抗体标记

每孔加入60 μL PBS重悬细胞，该板标记为板1。每孔移取20 μL细胞悬液至新的96孔板中，标记为板2。板1每孔加入50 μL的含FITC标记小鼠抗人活化PARP抗体、PE标记小鼠抗人P53抗体和Alexa Fluor®647标记小鼠抗人H2AX（pS139）抗体的PST溶液。板2中每孔加入50 μL含有pS28抗体的PST溶液。将板1和板2混匀后置于室温、避光条件下孵育1 h。标记结束时，每孔使用PBS洗涤1次并加入200 μL PBS溶液（含有7-AAD染液0.5 mg·L-1、RNA酶A 0.5 mg·L-1和计数微珠约1×108L-1）。室温条件下孵育10 min。

1.3.4 流式细胞术检测

孵育结束后，使用流式细胞仪检测荧光强度，分析细胞凋亡。用溶剂对照孔建立和调试模板，设置γ-H2AX（图1）和p-H3（图2）检测模板逻辑关系图，去除粘连细胞和坏死细胞，分析细胞的γ-H2AX荧光强度和P53蛋白荧光强度以及p-H3阳性细胞和凋亡细胞率。通过细胞和微珠计数比计算细胞毒性，细胞毒性（%）=1-（实验组细胞数-对照组细胞数）/微珠数×100%。

Fig.1 γ-H2AX，P53 protein expression and cell cycle detection templates.A：FL2-H vs SSC-A scatter diagram，set counting beads；B：FSC-A vs SSC-A scatter plot，set the cell gate；C：FSC-A vs FSC-H scatter plot，select single cells；D：SSC-A vs SSC-H scatter plot，select single cells；E：FL3-A channel（nucleic acid dye 7-AAD）fluorescence histogram，labling the necrotic cell peak（SUB-G1）；F：FL3-A vs FL1-A scatter plot，gate of cleaved-PARP positive cells,namely apoptotic cells；G：FL2-A channel fluorescence histogram，P53 protein fluorescence intensity gate；H：FL4-A channel fluorescence histogram，γ-H2AX fluorescence intensity gate.

Fig.2 p-H3 detection templates.A：FSC-A vs SSC-A scatter diagram，set counting beads and cells gate；B：FSC-A vs FSC-H scatter plot，to select single cell；C：SSC-A vs SSC-H scatter plot，to select single cell；D：FL3-A channel（nucleic acid dye 7-AAD）fluorescence histogram，labelling the necrotic cell peak（SUB-G1）；E：FL4-A vs FL3-A scatter plot，namely p-H3 positive cells gate.

1.4 体外多终点遗传毒性检测方法的验证

选择4种不同作用机制的DNA断裂剂（+S9条件下，丝裂霉素 C 0.05，0.1和0.2 mg·L-1，甲磺酸甲酯 3，6和12 mg·L-1，苯并芘 0.5，1，2 mg·L-1，顺铂2.5，5和10 mg·L-1；-S9条件下，丝裂霉素 C 0.025，0.05和0.1 mg·L-1，甲磺酸甲酯 1.5，3，6 mg·L-1，苯并芘 25，50和100 mg·L-1，顺铂 1.25，2.5和5 mg·L-1）、2种非整倍体诱导剂（+S9条件下，长春新碱0.005，0.01和0.02 mg·L-1，紫杉醇 0.02，0.04和0.08 mg·L-1；-S9条件下，长春新碱0.01，0.02和0.04 mg·L-1，紫杉醇0.005，0.01和0.02 mg·L-1）和3种不具有遗传毒性的化合物（+/-S9条件下，氯化钠 125，250和500 mg·L-1，氨苄青霉素 G 125，250和500 mg·L-1，盐酸普萘洛尔 15，30和60 mg·L-1），以依托泊苷、秋水仙素和环磷酰胺作为阳性对照品作用于TK6细胞，按1.3进行细胞处理、收获、固定、洗涤、抗体标记和流式细胞术检测。每个受试物按1∶1（V∶V）比例稀释，共配制3个浓度，每浓度设2复孔。每个受试物最高浓度选择见表1。

1.5 结果判定

受试物的作用机制依据各生物标志物的检测结果进行判断（表2）。γ-H2AX和P53蛋白表达荧光强度平均值及p-H3阳性细胞的百分比为溶剂对照组的2倍以上，则该指标为阳性。如受试物可引起γ-H2AX和P53蛋白阳性荧光表达升高，p-H3阳性细胞比例不升高，则该受试物为DNA断裂剂；如果受试物可引起p-H3阳性细胞比例显著升高，而γ-H2AX表达无明显变化，无论P53蛋白表达是否为阳性，该物质被判断为非整倍体诱导剂；如果受试物既不能引起γ-H2AX和P53蛋白表达阳性升高，也不能引起p-H3阳性细胞比例显著升高，则该物质可能是除DNA断裂剂及非整倍体诱导剂外的其他遗传毒性物质或不具有遗传毒性的化合物，需要进一步进行验证。

Tab.2 Evaluation criteria for biomarker test results

1.6 统计学分析

流式细胞仪检测数据使用BD Accuri C6TM（1.0.264.21版）导出。γ-H2AX和P53蛋白表达的荧光强度值和p-H3阳性细胞比例的平均值均以倍数x±s表示。当平均荧光强度高于对照组2倍时，判定为阳性结果。

2 结果

2.1 体外多终点遗传毒性检测方法建立

2.1.1 γ-H2AX、MP53蛋白表达和p-H3阳性细胞检测

图3A～C结果显示，依托泊苷0.8和1.6 mg·L-1（-S9）组和环磷酰胺 30 mg·L-1（+S9）组，诱导γ-H2AX表达的平均荧光强度高于对照组2倍，判定为阳性；与对照组相比，秋水仙素（-S9）各浓度组诱导γ-H2AX表达的平均荧光强度比值均低于2，判定为阴性。依托泊苷0.4，0.8和1.6 mg·L-1（-S9）组和环磷酰胺30 mg·L-1（+S9）组，诱导P53蛋白表达的平均荧光强度的比值高于对照组2倍，判定为阳性；秋水仙素0.025，0.05 mg·L-1（-S9）组P53蛋白表达的平均荧光强度高于2倍，判定为阳性。p-H3阳性细胞的百分比结果（图3D）显示，与溶剂对照组相比，依托泊苷（-S9）各组和环磷酰胺（+S9）各组p-H3阳性细胞的百分比随剂量增加而逐渐降低，秋水仙素（-S9）0.0125，0.025和0.05 mg·L-1诱导p-H3阳性细胞的百分比值增加（P＜0.01）。

Fig.3 Genotoxicity detection of ETO（A），CP（B）and COL（C）.Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells（D）treated with ETO，CP or COL for 4 or 24 h with（+S9）or without S9（-S9）.Low，mid，sub-high and high represent the concentration of each substance：ETO 24 h(-S9)：0.2，0.4，0.8 and 1.6 mg·L-1；CP 4 h(+S9)：3.75，7.5，15 and 30 mg·L-1；COL 24 h(-S9)：0.0063，0.0125，0.025 and 0.05 mg·L-1.x±s，n=3.＊：positive result.

2.1.2 依托泊苷、环磷酰胺和秋水仙素遗传毒性的判定

基于秋水仙素的γ-H2AX阴性，P53阳性，p-H3为阳性，因此可以判定秋水仙素为非整倍体诱导剂。依托泊苷和环磷酰胺可引起γ-H2AX和P53蛋白阳性荧光表达升高，p-H3阳性细胞比例不升高，因此可以判定依托泊苷和环磷酰胺为DNA断裂剂。依据方法建立试验的结果，选择依托泊苷1.6 mg·L-1和秋水仙素0.01 mg·L-1作为验证阶段的-S9组的阳性对照，环磷酰胺30 mg·L-1作为+S9组的阳性对照。

2.2 体外多终点遗传毒性检测方法验证

2.2.1 丝裂霉素C、甲磺酸甲酯和卡铂多终点遗传毒性检测方法验证

丝裂霉素C（图4）在+/-S9处理条件下可诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度及P53阳性细胞与对照组相比出现浓度相关性升高，p-H3无明显变化。甲磺酸甲酯（图5）在+/-S9处理条件下可诱导TK6细胞γ-H2AX荧光升高，P53蛋白表达荧光强度随着浓度先升高后降低，p-H3无明显变化。顺铂（图6）在+/-S9处理条件下可诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度及P53阳性细胞与对照组相比出现浓度相关性升高，p-H3无明显变化。苯并芘（图7）的实验结果表明，P53蛋白平均荧光强度和p-H3阳性细胞比例在+/-S9各剂量组并未出现明显变化，γ-H2AX平均荧光强度在100 μmg·L-1组出现显著性阳性升高（高于对照组2倍）。根据以上结果可判定丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、顺铂和苯并芘为断裂剂，且苯并芘需经S9体外代谢活化才具有DNA作用活性。

Fig.4 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells（C）treated with MMC（A）and with（B）or without（C）S9，alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.5 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with MMS（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.6 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with cDDP（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.7 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with B［a］P（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

2.2.2 紫杉醇和长春新碱多终点遗传毒性检测方法验证

紫杉醇（图8）在+/-S9条件下各剂量组γ-H2AX荧光强度均无剂量依赖性升高，p-H3阳性细胞比例和P53蛋白荧光强度相对于对照组升高并呈现明显的浓度-效应关系。长春新碱（图9）在+/-S9条件下各剂量组γ-H2AX荧光强度均无剂量依赖性升高，p-H3阳性细胞比例与对照组相比出现浓度相关性升高，P53蛋白荧光强度在0.02 mg·L-1组出现显著性阳性升高（高于对照组2倍）。根据该结果可判定紫杉醇和长春新碱为非整倍体诱导剂。

Fig.8 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with PT（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.9 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with VCR（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

2.2.3 氯化钠、氨苄青霉素G和盐酸普萘洛尔多终点遗传毒性检测方法验证结果

氨苄青霉素G（图10）、氯化钠（图11）和盐酸普萘洛尔（图12）组在+S9和-S9的条件下，所有受试浓度诱导γ-H2AX和P53蛋白表达的平均荧光强度及p-H3化的阳性细胞比例与溶剂对照组相比均无浓度依赖性阳性升高。提示氯化钠、氨苄青霉素G和盐酸普萘洛尔为DNA致断裂剂和非整倍体诱导剂以外的遗传毒性化合物或不具有遗传毒性的化合物。

Fig.10 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with Amp G（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.11 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the ratio of p-H3 positive cells treated with NaCl（A）and with（B）or without（C）S9，alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.12 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with Prop（A）and with（B）or without S9（C），alongside with vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

3 讨论

本研究首先以依托泊苷（-S9）、秋水仙素（-S9）和环磷酰胺（+S9）为遗传毒性阳性化合物建立了基于多色流式细胞术的体外多终点遗传毒性检测的检测模板和检测方法。该方法准确判断依托泊苷和环磷酰胺为DNA断裂剂，秋水仙素为非整倍体诱导剂。随后，使用4种断裂剂、2种非整倍体诱导剂和3种不具遗传毒性的化合物对该方法的灵敏度和特异性进行验证，结果表明该方法灵敏度高，特异性好。

在验证阶段的遗传毒性阳性化合物中，丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、顺铂和苯并芘均为已知的断裂剂，其中苯并芘的作用强度较弱，代谢活化后产生遗传毒性。本方法可准确判断丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、顺铂和苯并芘为断裂剂，且苯并芘需在+S9条件下才能反应出较弱的作用。该结果与可评价断裂剂的试验、体外微核试验的文献报道结果相符［8］。P53蛋白是间接反映DNA损伤修复的生物标志物。在本研究中，丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、顺铂和苯并芘均可诱导P53蛋白出现浓度依赖性升高。其中，甲磺酸甲酯诱导P53蛋白先升高，后降低，其原因可能为甲磺酸甲酯0.2 mg·L-1细胞毒性较强，导致细胞DNA受损严重，细胞坏死凋亡。坏死和凋亡的细胞也存在P53蛋白的表达。而本实验中，坏死和凋亡的细胞被排除计数，因此导致0.2 mg·L-1浓度时P53蛋白表达检测值降低［10］。

长春新碱和紫杉醇是经典的多倍体诱导剂，其作用机制是：①在细胞进行分裂时，使染色体的着丝点延迟分裂而形成多倍体；②诱导分裂中期的纺锤丝断裂，或抑制纺锤体的形成，使得分裂后期染色体不能移向两极而导致细胞停留在分裂中期［11］。本研究中，在+S9或-S9条件下，长春新碱和紫杉醇诱导TK6细胞产生的p-H3的阳性细胞比例相对于溶剂对照组均有阳性结果，且呈现出浓度-效应关系，可判定为非整倍体诱导剂，实验结果与文献报道的结果相符［12］。同时，长春新碱和紫杉醇均不能诱导γ-H2AX表达升高。但紫杉醇可以诱导P53蛋白表达升高，最高为溶剂对照的4.5倍，而长春新碱却未诱导P53蛋白表达升高。此结果提示，长春新碱和紫杉醇作用于纺锤体的机制可能不完全相同，具体原因有待进一步实验分析。

氯化钠、氨苄青霉素G和盐酸普萘洛尔是已知的不具有遗传毒性的化合物。本研究中，氯化钠、氨苄青霉素G最高浓度设为500 mg·L-1，为ICH遗传毒性指导原则S2（R1）对于无毒性化合物所推荐的最高浓度［12］。在+S9或-S9条件下，3种物质诱导TK6细胞的γ-H2AX和P53蛋白表达相对于溶剂对照组无明显变化，诱导P-H3细胞比例与溶剂对照组相比也无阳性升高。试验结果显示，以上3种物质未在体外多终点遗传毒性检测方法中检测出遗传毒性，与已发表文献中的结果一致［14］。

细胞核与计数微珠比率（核珠比）评价细胞毒性的结果显示，在+S9条件下，长春新碱、甲磺酸甲酯和苯并芘最高浓度的细胞毒性接近60%。在-S9条件下，紫杉醇、甲磺酸甲酯和顺铂在最高浓度的细胞毒性接近或超过60%。提示以核珠比计算得到的细胞毒性作为最高浓度选择依据时，比细胞计数法更为严格。

本研究还发现，由受试物引起的细胞凋亡，可以产生较大的γ-H2AX荧光强度波动。且由实验结果图可以发现，遗传毒性物质中细胞凋亡细胞比例与γ-H2AX荧光强度增加趋势相近，提示细胞凋亡可能会影响DNA双链断裂导致的γ-H2AX升高。本研究选择活化PARP作为细胞凋亡生物标志物，在流式细胞术检测中，通过门策略排除细胞凋亡过程激活胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3表达而产生的γ-H2AX［15］，可降低该法的假阳性。

本研究初步建立了基于多色流式细胞术的体外多终点遗传毒性检测方法。该方法使用p53基因完整的TK6细胞，同时引入核珠比计算细胞毒性，使用多终点生物标志物检测遗传毒性，单次试验即可获得多种化合物作用机制信息。流式细胞术分析方法和96孔板培养体系使该法可实现高通量快速检测，平均48 h即可获得测量结果。但是目前该实验方法尚缺乏广泛的试验数据支持和标准的操作规程，因此将该法用于化合物遗传毒性评价前仍需大量的试验研究。

综上所述，基于多色流式细胞术的体外多终点遗传毒性检测方法在检测化合物遗传毒理机制方面具有快速、准确、高效等优点，在进行遗传毒理研究方面有巨大潜力，未来可对药物、环境毒物等化合物进行高通量遗传毒性检测。