基于网络药理学和分子对接技术探讨藏药西藏猫乳抗类风湿性关节炎作用机制

王洪玲，李秋月，陈秋彤，刘 川，赵 芡，张英睿，张 艺，沈晓飞，张 静

（成都中医药大学1.民族医药学术传承创新研究中心，2.民族医药学院，3.药学院，4.附属医院，四川 成都 611137）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属于藏医“真布病”范畴，其病程长，病源广，致残率高，预后差，在藏医研究中备受关注［1］。藏药西藏猫乳又叫“森等”，藏语称为毕曾兴，为鼠李科猫乳属植物西藏猫乳（Rhamnella gilgitica Mansf.et Melch.）茎的干燥木质部（俗称心材），为藏医治疗RA 常用药物之一［2-3］。《四部医典》［4］记载：“森等凉血，敛干黄水”。《晶珠本草》［5］谓：“森等燥血，干黄水”。《藏药志》［6］中亦明确指出，“森等凉、燥、湿；能活血，干黄水，治麻风病。”《卫生部药品标准·藏药》记载西藏猫乳味苦，性凉，具有凉血、消肿的功效，用于治疗RA、黄水病，高山多血症，常外敷于患处［7］。《实用藏药名库》中记载了以西藏猫乳为君药的6种常用于治疗关节肿痛的常用方剂，分别是猫乳独味汤、四味猫乳汤散、七味猫乳药酥油、九味猫乳药酥油、二十三味猫乳散和二十五味猫乳丸［8］。

西藏猫乳含有墨沙酮、柚皮素和山奈素等黄酮类及大黄酚、没食子酸、β-谷甾醇、混合脂肪酸和混合脂肪酸酯等化合物［15-18］；药理学研究表明，西藏猫乳具有抗炎、镇痛和抗氧化等作用，可明显改善RA症状［9-13］。藏医临床上亦有用西藏猫乳为君药治疗关节红肿疼痛等疾病的报道［14］。但目前对西藏猫乳研究尚浅，尚未探讨其作用机制。本研究通过网络药理学和分子对接技术对西藏猫乳抗RA的作用机制进行探讨，为后期研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件

数据库有 UniProt（https：//www.uniprot.org/）（2020-08-03），Drug Bank 5.17（https：//www.drugbank.ca/）（2020-07-02），Therapeutic Target Database（TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）（2020-01-06），Gene Card-Human Genes 5.0（https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/）（2020-07-27），STRING 11.0（https：//string-db.org/）（2020-01-19），DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）（2020-08-20），Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）（2019-03-01），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/index.php）（2018-04-05），RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）（2020-07-10），ZINC 15（http：//zinc.docking.org/）（2017-02-09）和 Omi share Tools（http：//www.omicshare.com/tools）（2016-04）。软件有 Cytoscape3.7.2（http：//www.cytoscape.org/），Maestro version 11.5（https：//www.schrodinger.com/Maestro/）和 Chem Draw Professional 16.0（美国PerkinElmer公司）。

1.2 药物、试剂和仪器

芹菜素、鼠李柠檬素和山奈素均是本实验室分离所得（纯度均＞98.0%），BAY11-7082（NF-κB抑制剂）购自美国Med Chem Express公司，均用二甲亚砜溶解，配制成200 mmol·L-1的母液，用时加含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释至所需浓度。二甲亚砜（纯度＞99.5%），成都市科隆化学品有限公司；胎牛血清、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和DMEM培养基，上海浩然生物技术有限公司；Griess检测试剂盒，美国Promega公司；小鼠RAW264.7巨噬细胞，国家实验细胞资源共享平台。SW-CJ-1FD超净工作台、Forma3111型水套式CO2培养箱、96孔细胞培养板，美国Becton Dickinson公司；XDS-IB型倒置生物显微镜，重庆光学仪器厂；5424R低温离心机，德国Eppendorf；Victor1420型多功能标记分析仪，美国Perkin Elmer公司；1/10万级Sartorius BP121S电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

1.3 西藏猫乳化合物与其抗RA的潜在作用靶点信息筛选

采用Chem Draw Professional 16.0软件绘制西藏猫乳化学成分的结构，利用PubChem数据库，将所有的化合物都转化为标准的Canonical Smiles格式，将其继续导入Swiss Target Prediction数据库设置属性为“Homo sapiens”，获取化学成分作用靶点信息。

利 用 Drug Bank，TTD（Therapeutic Target Database）和Gene Card-Human Genes数据库以“rheumatoid arthritis”为关键词搜索疾病靶点，其中Gene Card-Human Genes选择相关性得分＞5筛选疾病靶点。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPl）网络构建

将潜在作用靶点导入STRING 11.0数据库，获得蛋白质相互作用数据，将相关数据导导入Cytoscape3.7.2软件，构建PPI图。

1.5 相关通路的获取和“化学成分-靶点-通路”网络建立与分析

将获得的潜在作用靶点信息导入DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。将结果导入Omi share Tools绘制对应的柱形图和高级气泡图。以选取化学成分、预测的潜在作用靶点和通路及化学成分为节点，建立相互关系，导入Cytoscape3.7.2，构建西藏猫乳“化学成分-靶点-通路”的网络图。

1.6 分子对接验证

筛选出西藏猫乳的主要化学成分和靶点，借助RCSB PDB数据库下载靶点的3D结构，保存为PDB格式。借助ZINC数据库下载化学成分3D结构的mol格式文件。将主要作用靶点的3D结构导入软件Maestro version 11.5软件进行去水、加氢、能量最小化等操作，运用glide进行分子对接，以结合能值评价受体与配体匹配的稳定性。

1.7 MTT法检测RAW264.7巨噬细胞存活率

用含有10%胎牛血清的DMEM作为培养基，将RAW264.7巨噬细胞于37℃，5% CO2培养箱进行培养（2～3 d传代1次）。取对数生长期细胞以2.5×108L-1接种到96孔板内，每孔100 μL，每组设6复孔，在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。弃培养液，除细胞对照组加入100 μL完全培养基代替药物外，山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素组分别给予含药（药物浓度为5，10，20，50，100和200 μmol·L-1）培养基100 μL，培养24 h。弃上清后，每孔加入100 μL MTT溶液（5 g·L-1），4 h后终止培养，每孔加100 μL二甲亚砜避光低速振荡10 min，于590 nm波长处测定吸光度A590nm。细胞存活率（%）=药物组A590nm/细胞对照组A590nm×100%。

1.8 Griess法检测RAW264.7巨噬细胞一氧化氮（nitric oxide，NO）释放量

取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以2.5×108L-1接种到96孔板内，每组设6复孔，每孔100 μL，在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。弃上清，除细胞对照组和LPS组加入不含药物的培养液100 μL外，BAY11-7082组加入含BAY11-7082（浓度为5 μmol·L-1）的培养液 100 μL；山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素组分别加入含山奈素、鼠李柠檬素或芹菜素（药物浓度为5，10，20，50和100 μmol·L-1）的培养液100 μL预处理2 h后，除细胞对照组外，其余各组均加入LPS（浓度为0.5 mg·L-1）10 μL继续培养24 h。24 h后吸取各孔细胞上清液，按Griess试剂盒方法测定上清液中NO含量。

2 结果

2.1 西藏猫乳化合物与其抗RA的潜在作用靶点信息筛选

文献检索发现，西藏猫乳化学成分有21个［2，11，15-17］，前期课题组分离得到 17 个［18］，除去相同化学成分，共有34个化学成分（表1）。使用Chem Draw Professional 16.0软件绘制34个化学成分的结构，将化合物以Canonical Smiles格式导入Swiss Target Prediction数据库并设置属性为“Homo sapiens”，获取化学成分作用靶点信息。按1.3方法，整合除去重复靶点，得疾病靶点。将预测得到的化学成分作用靶点与疾病靶点进行对比分析，得到化学成分作用的潜在靶点68个（表1）。

Tab.1 lnformation on 68 potential targets of 34 chemical constituents in Rhamnella gilgitica Mansf.et Melch（RG）

Tab.1(continued)

2.2 “化学成分-靶点-通路”网络建立与分析

将与西藏猫乳化学成分作用的68个潜在作用靶点通过DAVID数据库分析，得到靶标蛋白参与的所有途径，筛选出靶标蛋白显著参与途径（P＜0.05），共筛选出80条显著代谢途径，通过Cyto-scape3.7.2软件构建“化学成分-靶点-通路”见图1。共有177个节点和827条边，根据网络的拓扑学性质筛选等级值较大的节点进行分析，这些连接化合物或靶点较多的节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点。

Fig.1 Components-targets-KEGG pathway network of RG against RA.68 potential targets were analyzed by DAVID database，and 80 related pathways were obtained（P＜0.05）.The 29 chemical components，68 potential targets and 80 pathways obtained were imported to Cytoscape 3.7.2 software to obtain the network of“Components-targets-KEGG pathways”.The yellow circle represents 29 chemical components，the green circle represents 68 potential targets，and the purple square represents 80 KEGG pathways.

以“化学成分-靶点-通路”网络图设置等级值（degree）≥14为核心化学成分，筛选出9个主要化学成分，可能为西藏猫乳活性成分，分别为Tristin、1，2-二（4-羟基苯基）乙烷、柚皮素、槲皮素、（-）-南烛木树脂酚、鼠李柠檬素、山奈素、芹菜素和大黄酚；通过选取degree≥22为潜在作用靶点，得到9个靶点，分别为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（protooncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）、胰岛素样生长因子1受体（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、人源重组蛋白RELA、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基 δ（phosphoinositide-3 kinase，catalytic subunit delta，PIK3CD）和磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）；通过关联的80条通路分析，发现西藏猫乳化学成分作用靶点涉及疼痛、炎症和RA等相关调节通路。

2.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建

将2.1通过Swiss Target Prediction，Drug Bank和TTD等数据库筛选的68个潜在作用靶点，上传到STRING 11.0数据库，并将物种限定为“Homo sapiens”，下载标签分隔值文件导入Cytoscape3.7.2软件，对分析结果进行可视化展示得到PPI网络图（图2）。

Fig.2 Protein-protein interaction（PPl）network of potential targets of RG for RA intervention.The 68 potential targets were uploaded to the STRING 11.0 database，and the Tab Separated Values（TSV）file was obtained via limiting species to“Homo sapiens”.The TSV file was imported into Cytoscape 3.7.2 software to analyze the PPI network of 68 potential targets.The circles in the figure from large to small represent the size of degree value，and the larger the circle，the more likely it is a key target.

2.4 靶点通路分析

通过将68个潜在作用靶点导入DAVID数据库进行GO生物学功能注释和KEGG通路富集分析，将结果导入Omi share Tools绘制对应的柱形图及高级气泡图。得到GO功能富集分析GO条目318个（P＜0.05），其中生物过程（biological process，BP）条目224个，细胞组成（cell composition，CC）条目32个，分子功能（molecular function，MF）条目62个，部分条目（靶点数≥10）（图3）。KEGG通路富集筛选得到80条信号通路（P＜0.05），选取（P＜0.02，count≥5）前25个通路利用气泡图进行可视化（图4）。富集结果分析得知，西藏猫乳化学成分作用靶点涉及类风湿性关节炎、疼痛、炎症等相关调节通路。

Fig.3 Enrichment analysis of Gene Ontology（GO）biological process of RG on potential targets for intervention of RA.GO function enrichment analysis was performed through DAVID，and the histograms map was plotted by Omic share database for visualization.Biological process（BP），cell composition（CC）and molecular function（MF），the red line is the P value of the GO entry.And the GO items are on the left side of the graph，the count represents the number of genes.

Fig.4 Enrichment analysis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway of RG on potential target for intervention of RA.KEGG pathway enrichment analysis was performed through DAVID，and bubble map was plotted by Omic share database for visualization.The KEGG pathways are on the left side of the graph，and the count represents the number of genes enriched in the KEGG.The size of the circle represents the number of genes enrichments，and the color represents the P value.

2.5 西藏猫乳分子对接验证

对GO富集分析靶点排列前10的条目靶点进行筛选，选出9个出现频率较高的潜在作用靶点，分别为雄激素受体（androgen receptor，AR）、EGFR、IGF1R、热休克蛋白 90AA1（heat shock protein 90AA1，HSP90AA1）、SRC、MAPK8、Akt1、PIK3R1和RELA，与9个主要化学成分Tristin、1，2-二（4-羟基苯基）乙烷、柚皮素、槲皮素、（-）-南烛木树脂酚、鼠李柠檬素、山奈素、芹菜素和大黄酚进行分子对接，以结合能值评价受体与配体匹配的稳定性。将上述9个主要化学成分与9个潜在作用靶点分别进行分子对接，结果见表2。

一般认为进行分子对接时配体和受体的结合能越低，构象越稳定，发生作用的可能性越大，结合能＜0说明配体和受体可以自发结合［19］。表2结果显示，其中鼠李柠檬素与AR、芹菜素与HSP90AA1和IGF1R、柚皮素与MAPK8、EGFR和RELA、山柰素与SRC、Tristin与Akt1、槲皮素与PIK3R1结合能最小，构象稳定，发生作用的可能性大，其中芹菜素和柚皮素潜在作用靶点多，分子对接模式见图5。

Fig.5 Docking results of main compounds and targets in RG.The 3D structure of AR，HSP90AA1，IGF1R，MAPK8，EGFR，SRC，Akt1，PIK3R1 and RELA were imported into Maestro version 11.5 software for molecular docking.The docking mode of the above nine compounds corresponded to nine core targets.The figure represents the docking mode，with 3D mode on the left and 2D mode on the right.

2.6 山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素对RAW264.7巨噬细胞存活的影响

由表3结果表明，山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素5～100 μmol·L-1作用于RAW264.7巨噬细胞，其细胞存活率均＞90%，表明山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素在5～100 μmol·L-1无细胞毒性作用。

Tab.2 Prediction of conjunction of active ingredients and key targets in RG

Tab.3 Effect of kaempferol，apigenin and rhamnocitrin on RAW264.7 cell viability

2.7 山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO释放的影响

由表4可见，与细胞对照组比较，经LPS诱导后RAW264.7巨噬细胞NO释放升高（P＜0.05）。在5～100 μmol·L-1浓度范围内，山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素均不同程度抑制了NO的释放。表明山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。

Tab.4 Effect of kaempferol，rhamnocitrin and apigenin on nitric oxide（NO）release induced by lipopolysaccharide（LPS）in 264.7 macrophages

3 讨论

网络药理学是基于系统生物学，对“化学成分-靶点-通路”网络进行分析，从整体层面分析中药的药效物质基础和分子作用机制。分子对接技术是研究药物分子和蛋白受体之间的相互作用，并能预测配体-受体结合模式和亲和力的一种虚拟筛选方法。本研究整合网络药理学和分子对接技术探究藏药西藏猫乳治疗RA的作用机制。首先本研究在Swiss Target Prediction数据库中查找通过文献检索和前期课题组分离得到的西藏猫乳化学成分对应的靶点，结合Drug Bank、TTD和Gene Card-Human Genes数据库获得的RA相关靶点，筛选出西藏猫乳化学成分作用的潜在靶点。再采用DAVID数据库对潜在靶点进行GO富集和KEGG通路分析，使用Omi share Tools数据库绘制对应的柱形图及高级气泡图，然后采用Cytoscape3.7.2软件构建“化学成分-靶点-通路”和PPI网络图。最后采用分子对接技术和细胞抗炎活性实验进一步对网络药理学分析得的活性成分进行验证。最终获得6个核心成分和9个核心靶点，且细胞实验揭示山奈素、鼠李柠檬素和芹菜素对RAW264.7巨噬细胞中NO释放量皆有抑制作用，表明这3个化合物确有抗炎作用。

通过构建“化学成分-靶点-通路”网络图，得到西藏猫乳化学成分作用相关的9个核心靶点，分别是 SRC，mTOR，IGF1R，EGFR，MAPK8，RELA，Akt1，PIK3CD和PIK3R1。同时，通过功能富集分析发现，这些靶点主要作用于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MAPK、NF-κB、T细胞受体和mTOR等信号通路。研究表明，RA形成过程中NF-κB，MAPK和VEGF等信号通路均被激活［21-23］。其中，NF-κB作为一种核转录因子，可调节多种细胞因子、生长因子和氧化应激相关酶等表达，在细胞分化、凋亡、黏附、炎症和免疫应答等方面影响RA的发生和发展［24］。现代研究表明，藏药翼首草通过调节MAPK和VEGF信号通路来抑制炎症细胞因子的产生和表达，减少胶原蛋白的产生、抑制滑膜细胞增殖并减弱其侵袭能力，从而发挥抗RA作用［25］。综上分析，西藏猫乳可能通过调节炎症、免疫和内分泌等通路，发挥治疗RA的作用。

通过分子对接技术筛选出评分最高的活性化学成分均为黄酮类，分别是鼠李柠檬素、芹菜素、柚皮素、山奈素、槲皮素和Tristin。同时采用Griess法检测RAW264.7巨噬细胞中NO释放量，验证鼠李柠檬素、山奈素和芹菜素的抗炎活性。实验结果发现，鼠李柠檬素、山奈素和芹菜素可有效抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO的释放，表明它们具有抗炎作用。黄酮类成分广泛存在于自然界中，是植物主要活性成分之一，主要通过抑制炎症因子产生、调节信号通路、抗氧自由基免疫调剂等达到治疗RA的作用［26］。相关研究发现，柚皮素具有促成骨作用和抑制破骨作用，具有抗炎、抗过敏和抗菌等作用［27］。王友庆等［28］研究表明，槲皮素可通过抑制NF-κB激活，减弱炎症环境下软骨细胞内基质金属蛋白酶13产生、基质降解和细胞凋亡，起到保护软骨的作用。古秋莉等［29］研究发现，鼠李柠檬素对于肿胀、渗出急性炎症模型和肉芽肿慢性炎症模型具有一定的抑制作用。山奈素可通过调节炎症相关蛋白表达以及抑制转录因子激活等方式减少炎症因子的产生，抑制炎症的发生和发展［30］。慕佳冶［31］研究发现，山奈素对大鼠佐剂性关节炎病情有很好的改善作用，其治疗大鼠佐剂性关节炎的作用机制可能与其提高大鼠的抗氧化能力和其免疫调节并抑制细胞炎症因子有关。潘东梅［32］通过山奈素对小鼠RA的治疗研究，得出山奈素对RA滑膜炎症以及髓后的关节破坏均有一定的治疗作用。梁清华等［33］研究证明，芹菜素对T细胞的增殖及白细胞介素2，干扰素γ和白细胞介素4 mRNA表达具有抑制作用，提示芹菜素具有免疫抑制作用。此外，阚伟娟等［34］研究表明，芹菜素通过下调一氧化氮合酶蛋白表达，抑制巨噬细胞产生NO，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子从而发挥抗炎作用。综合分子对接、细胞实验及相关文献报道等分析，可部分验证本研究网络预测结果，推测西藏猫乳发挥抗RA的作用与黄酮类化学成分通过调节免疫、炎症相关蛋白表达和血管生成等有关，与抗RA药物调节通路相符合。

传统藏医学认为，RA主要是由于环境、饮食、起居行为等不当引起机体“三因”失衡，进一步引起代谢失常、功能紊乱，使得黄水增生，侵害肌肉、关节甚至骨骼等整个机体［35］。藏医临床治疗RA以干黄水为原则，通常从饮食、起居行为、药物和外治4个方面入手。其中药物治疗主要以内服散寒除湿、消肿止痛药物为主，而西藏猫乳味苦，性凉，具有凉血、消肿之功效，是藏医临床治疗RA的常用药。现代研究也证明，西藏猫乳对RA有明确的治疗作用。如裴小娜等［11］研究表明，西藏猫乳提取物具有一定的镇痛抗炎活性，对RA具有治疗作用；Shan等［12］研究发现，西藏猫乳提取物可有效治疗完全弗氏佐剂诱导的大鼠关节炎，有望开发为治疗炎症的药物；谢敏等［36］通过研究西藏猫乳不同提取部位镇痛抗炎活性，发现西藏猫乳总黄酮对骨关节炎具有治疗作用。朵日毛等［14］报道，临床上用西藏猫乳治疗关节红肿疼痛多例，确有良效。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接技术以及细胞实验，对西藏猫乳“多成分-多靶点-多途径”的复杂网络关系进行研究，发现西藏猫乳抗RA的主要化学成分为黄酮类，如鼠李柠檬素、芹菜素和山奈素，且这些成分可通过调节免疫、炎症相关蛋白表达和血管生成等发挥抗RA的作用。本研究初步揭示西藏猫乳的分子调控网络，为深入研究其抗RA作用机制提供参考。