黄芪主要活性成分对糖尿病肾病的疗效机制研究进展

倪慧明，董哲毅，陈香美*

1广东药科大学中药学院，广州 510006；2解放军总医院肾脏病科/解放军肾脏病研究所/肾脏疾病国家重点实验室/国家慢性肾病临床医学研究中心/肾脏疾病研究北京市重点实验室，北京 100853

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是典型的糖尿病微血管病变[1]，也是糖尿病最常见的并发症[2]。近年来，DN的发病率急剧增高，1980－2019年中国约有21.8%的2型糖尿病患者罹患DN[3]。DN临床上常表现为尿白蛋白水平升高及肾小球滤过率降低，其机制为血流动力学的改变及肾小球滤过屏障受损[4-5]。DN患者的入球小动脉扩张及出球小动脉阻力增加，使肾小球呈高灌注、高滤过状态，从而导致肾小球系膜细胞增生、基底膜增厚，肾小球硬化伴结节性系膜病变等组织病理学改变[6]。目前，血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体阻滞剂的应用是延缓DN进程的重要手段，但仍然有较多患者继续进展至终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)[7]。新近的研究表明，钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂可有效降低血糖，控制蛋白尿的发生，降低肾衰竭及心血管事件的发生率[8]，对DN有良好的治疗作用，但有小部分患者在使用此药物时会出现生殖器真菌感染、糖尿病酮症酸中毒等不良反应[9]。因此，为了有效控制DN的发展，阻止DN进程，须探索更多高效、安全的治疗药物。

在我国，以黄芪为代表的中草药已广泛应用于DN的临床治疗。黄芪是豆科多年生草本植物——蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，具有补气升阳，利尿消肿等功效[10]。黄芪所含化学成分复杂，主要包括黄酮类、皂苷类、多糖类及氨基酸类物质[11]。 其中黄芪甲甙(astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)及黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是其主要活性成 分[12-13]。本文主要对AS-Ⅳ及APS治疗DN的机制进行综述，旨在为其进一步的药理研究及临床应用提供理论依据。

1 黄芪主要活性成分的药理作用

AS-Ⅳ及APS均具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等药理作用[12-14]。AS-Ⅳ可抑制促炎细胞因子的产生，增加γ干扰素的基因表达，增强免疫应答，对扩张型心肌病、乙型肝炎病毒感染等疾病具有潜在的治疗作用；调节线粒体自噬，保护线粒体功能，发挥抗氧化活性[14]；调节过度免疫反应，增加细胞毒性T淋巴细胞，从而减少肿瘤细胞的侵袭及转移，控制肿瘤进展；还可治疗多发性硬化、类风湿关节炎等自身免疫性疾病[12]。许多研究表明，AS-Ⅳ对心[15]、肺[16]、肾脏[17]及神经系统[18]均有保护作用。APS可通过增强T细胞、B细胞等免疫细胞的功能，提高免疫调节活性[13]。有研究发现，APS对肾结石有预防和治疗作用[19]。此外，APS不仅能增强化疗药物的抗癌作用[14]，还能明显抑制并杀灭肿瘤细胞[20]。

2 黄芪主要活性成分对DN的疗效作用机制

DN发病机制复杂，多种致病因素如内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、炎症、细胞损伤及凋亡、肾组织纤维化、糖脂代谢异常等，均可导致糖尿病肾损害。AS-Ⅳ及APS对上述致病因素具有明显的抑制及改善作用。

2.1 调节内质网应激 内质网是蛋白质折叠的“工厂”，是分泌性蛋白及生物膜蛋白加工并转运至高尔基体的关键场所，也是细胞内Ca2+存储的重要部位。当发生某些病理生理应激时，会导致内质网腔内众多未折叠蛋白及错误折叠蛋白积聚，内质网内环境及Ca2+稳态失衡，从而引发过度的ERS[21]。内质网膜上存在3种蛋白传感器——蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇依赖酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)及活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)，均为介导ERS的重要分子，能够调节内质网级联反应通路[22]。ERS参与了包括DN在内的多种肾脏疾病的病理生理过程，因此，通过药物治疗恢复内质网功能的平衡，是预防或阻止肾脏疾病进展的有效方法[23]。有研究发现，APS可通过抑制PERK磷酸化，降低ERS标志物CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)的同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)水平，从而恢复内质网功能稳态[24]。Guo等[25-26]采用自发性和诱发性两种糖尿病动物模型，即db/db小鼠和链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病小鼠进行研究，均发现小鼠肾脏组织中PERK、IRE-1α、ATF6及其下游靶点被激活，CHOP表达明显升高，磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)和裂解的半胱氨酸天门冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-12等ERS诱导细胞凋亡的因子表达增加，以上情况均可由AS-Ⅳ逆转。另有研究发现，AS-Ⅳ可减少DN大鼠肾组织中ERS标志物——葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)的表达，抑制过度ERS的发生[27]。综上，黄芪的主要活性成分可通过抑制PERK、IRE-1α、ATF6所介导的ERS信号通路的活化，降低CHOP、GRP78等ERS相关蛋白的表达水平，从而减轻ERS及其诱导的细胞凋亡，发挥对DN的保护作用。

2.2 抗炎、减少细胞凋亡

2.2.1 抗炎 炎症是DN病程进展的中心环节。在DN动物模型及患者肾组织中均发现炎性细胞浸润，随着炎性细胞大量聚集，肾小球、肾小管出现严重损害。因此，抗炎是减缓DN进展的有效方式之一。在DN病理发展过程中，不同的代谢途径及细胞因子被激活，如Janus激酶/信号转导和转录激活因子(Janus tyrosine kinase/signal transducer and transcription activator，JAK/STAT)信号通路，核转录因子κB(the nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)、核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)等[28]。AS-Ⅳ可通过作用于以上通路或细胞因子，减轻炎症反应及细胞凋亡[29-31]。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是影响DN患者体内巨噬细胞积聚的关键，而某些炎性因子诱导的MCP-1表达则成为肾脏炎症发生的启动因素。有观点认为，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α是MCP-1最有效的诱导剂[28]。AS-Ⅳ可抑制db/db小鼠MCP-1及TNF-α的表达上调，减轻肾脏炎症，降低蛋白尿，有效改善肾小球肥大及系膜基质增厚[25]。

2.2.2 减少足细胞凋亡 足细胞是维持肾小球滤过膜屏障功能及结构的主要细胞，也称肾小球脏层上皮细胞。目前，保护足细胞已成为治疗肾小球损伤的有效方式之一[32]。微小RNA(microRNA，miRNA)及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)与足细胞的损伤及凋亡密切相关，二者均属于非编码RNA，可以RNA的形式参与蛋白编码基因的调控。TNF受体相关因子5(tumor-necrosis factor receptor-associated factor 5，TRAF5)是TRAF家族的成员之一，参与NF-κB等炎性因子的激活，TRAF5过表达可明显抑制细胞活性，诱导足细胞凋亡[33]。研究发现，AS-Ⅳ可使高糖诱导的小鼠足细胞miR-378表达增高，而miR-378可靶向负调控TRAF5，因此，AS-Ⅳ可通过miR-378/TRAF5信号通路抑制足细胞凋亡，miR-378及TRAF5可作为治疗DN的新靶 点[34]。DN还受某些lncRNA的调节。研究发现，长链非编码RNA-牛磺酸上调基因1(lncRNA-TUG1)与TRAF5表达呈负相关，而AS-Ⅳ可调节二者的平衡，通过升高lncRNA-TUG水平，降低TRAF5的过表达，从而减轻高糖诱导的足细胞凋亡，对DN起靶向治疗作用[35]。

2.2.3 减少内皮细胞凋亡 内皮功能障碍是DN的病理特征之一[36]。内皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)在肾脏疾病中不仅发挥调节血管生成的作用，还能修复内皮细胞损伤，激活内皮细胞一氧化氮(nitric oxide，NO)的释放。糖尿病患者体内eNOS活性受到抑制，NO的生成量及生物利用度大大降低，导致内皮功能障碍，成为DN的起始环节[37]。eNOS的活性还可通过其磷酸化来调节。AS-Ⅳ可加速DN大鼠体内血清及肾组织中的NO合成，促进eNOS磷酸化，明显增强其活性，减轻内皮细胞损伤，同时在高糖环境下，AS-Ⅳ还可降低人肾小球内皮细胞的通透性，减少细胞凋亡[38]。

2.2.4 减少肾小管上皮细胞凋亡 DN的病理因素还包括肾小管上皮细胞损伤，当其损伤加重时，可加速DN向ESRD的进展[39]。Ju等[27]建立高脂饮食及小剂量STZ诱导的DN大鼠模型，模型组出现典型的肾小管上皮细胞损伤表现，包括肿胀、肥大、脱落，肾小管空泡样变、基底膜增厚，间质胶原沉积等特征性病理改变，AS-Ⅳ治疗后上述组织病理学改变明显好转，凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值下调，裂解的caspase-3表达水平降低，细胞凋亡减少。Wang等[31]采用TUNEL染色法检测高糖诱导的HK-2细胞凋亡情况，模型组中阳性细胞数量明显多于对照组，而经AS-Ⅳ处理后HK-2凋亡明显减少。Nrf2是外源性毒性物质及氧化应激的靶点，具有关键的防御效应。抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)可启动解毒及抗氧化应激的基因转录，保护细胞生物系统免受外源性毒物及氧化剂的损害[40]。AS-Ⅳ可增强Nrf2及其下游基因——血红素加氧酶-1(HO-1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、醌氧化还原酶1(NQO1)mRNA的表达，调节Nrf2/ARE信号通路，从而对高糖诱导的HK-2细胞凋亡及氧化应激损伤发挥保护作用[31]。APS也具有同样显著的效应。在高糖条件下，APS可通过下调JAK/STAT信号通路，抑制HK-2细胞凋亡及转分化的发生，并能减少细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的生成和氧化损伤[29]。APS对HK-2细胞的保护作用还与其抑制Wnt信号通路相关[41]。由此可见，黄芪主要活性成分能够抑制Bax、caspase-3等细胞凋亡蛋白的表达，增强Nrf2及其靶基因HO-1、Keap1、NQO1的mRNA表达水平，调节Nrf2/ARE通路，减轻氧化应激导致的细胞损伤，并可抑制JAK/STAT及Wnt信号通路，减少肾小管上皮细胞凋亡，最终延缓DN的病理 进程。

2.3 抑制纤维化进程 在DN进展过程中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积可导致肾纤维化的发生。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是肾脏炎症及纤维化发展的重要因子，与上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)密切相关，TGF-β1过表达可加剧ECM的累积。Wang等[30]发现，在高糖诱导的小鼠永生化足细胞中，AS-Ⅳ可抑制TGF-β1的表达，并可激活沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)-NF-κB通路，抑制高糖诱导的足细胞EMT；此外，AS-Ⅳ可减少KK-Ay小鼠的微量白蛋白尿，并减轻ECM的过度沉积及肾脏纤维化。TGF-β1可通过调控下游的信号分子发挥其生物学效应。Smad3及Smad7均为TGF-β1的下游分子。在高糖条件下，Smad3表达增多可引发肾脏纤维化及炎症，进而导致肾功能障碍[42]。同时，Smad7可负调控Smad3的活化。Mao等[43]研究发现，AS-Ⅳ可降低miR-192和TGF-β1、Smad3、肌动蛋 白α、Ⅰ型胶原蛋白等纤维化相关蛋白的表达，增加Smad7的表达，并呈剂量依赖性地减轻高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖，其机制可能是通过TGF-β1/Smad/miR-192通路抑制肾纤维化的产生及系膜细胞的过度增殖。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)为一类含锌的肽链内切酶，可降解ECM，是观察DN预后的重要因子。组织金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)为MMP的抑制剂，这两种蛋白对维持ECM合成及降解的平衡具有积极的作用[40]。有研究发现，APS可抑制TGF-β1/Smad信号通路，调控其下游信号分子，升高MMP-2、MMP-9的表达，并降低TIMP-1、TIMP-2的表达，最终可减轻肾脏纤维化损伤[44]。

2.4 调节糖、脂代谢 众所周知，糖类及脂肪代谢异常是糖尿病的典型特征。在2型糖尿病的进程中，代谢器官及组织中胰岛素敏感性逐渐丧失，出现胰岛素抵抗，最终发生胰岛β细胞功能衰竭，导致高血糖及其他并发症的发生。改善胰岛素敏感性是治疗2型糖尿病及DN等代谢性疾病的有效方式。脂肪组织是胰岛素刺激葡萄糖摄取的主要靶点，胰岛素抵抗则会影响葡萄糖的摄取。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)及C/EBPα是脂肪细胞形成过程中的两个关键转录因子，可诱导前体脂肪细胞向脂肪细胞分化，参与葡萄糖和脂质代谢。Zhang等[45]采用小鼠3T3-L1前体脂肪细胞进行研究，发现APS可促进细胞增殖，使细胞内PPARγ和C/EBPα的表达升高，此外，负责摄取葡萄糖的主要转运蛋白——葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，Glut4)的mRNA及蛋白表达水平升高，且AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)含量也明显增加。AMPK参与了机体的能量代谢过程，是调控能量代谢及胰岛素敏感性的中间环节，其活性与胰岛素敏感性呈正相关。以上结果均表明，APS可增加脂肪细胞对葡萄糖的摄取，并激活AMPK，从而提高胰岛素敏 感性。

AS-Ⅳ是一种新型的PPARγ激动剂[46]，可增强db/db小鼠PPARγ的表达，从而调节小鼠体内的葡萄糖稳态及脂质代谢[25]。以PPARγ为靶点进行靶向治疗是维持血糖水平和脂质稳态的有效方式。肾脏内脂质沉积及过量游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)累积可导致肾小管上皮细胞损伤，而AS-Ⅳ可减少脂质在HK-2细胞内的沉积，减轻细胞损伤及凋亡[47]。体内脂质代谢异常可导致肾脏纤维化，而恢复脂肪酸代谢则可避免肾脏纤维化的发生[48]。Su等[49]发现，AS-Ⅳ可下调棕榈酸酯诱导的人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells，HMCs)中CD36的表达，减少FFAs的吸收，从而抑制HMCs纤维化及氧化应激的发生。CD36是FFAs摄取的主要转运蛋白，在调控糖尿病等代谢性疾病中具有重要意义。

3 总结与展望

在DN等代谢性疾病的治疗过程中，寻找有效的靶向治疗方案十分关键。国际上对中医药治疗越来越重视，且对中药的药理研究也日渐深入。黄芪是中医组方应用中最经典、最常用的中药之一，其主要活性成分AS-Ⅳ及APS在治疗DN方面具有积极的作用。首先，可抑制PERK、IRE-1α、ATF6等介导ERS发生的主要分子的活化，调节内质网级联反应通路，恢复内质网功能稳态，预防DN进展；其次，作用于肾小管上皮细胞，下调JAK/STAT信号通路及Wnt信号通路，上调Nrf2/ARE信号通路，从而抑制细胞凋亡，抑制高糖诱导的足细胞NF-κB、MCP-1、TNF-α等炎性因子的表达，减轻肾脏炎症反应；再次，作用于系膜细胞，可抑制TGF-β1/Smad信号通路，减轻系膜细胞的异常增殖，调控MMP系列分子，平衡ECM的合成与降解，减轻肾脏的纤维化程度；最后，增加PPARγ及C/EBPα的表达，提高胰岛素敏感性，增强脂肪细胞摄取葡萄糖的能力，减轻糖脂代谢紊乱。

有学者基于系统药理学的方法，从分子水平到病理水平深入探讨了AS-Ⅳ治疗DN的作用机制，发现AS-Ⅳ可通过多靶点多通路协同治疗DN，为后续探索中药有效成分提供了全新的方法及思路[50]。目前，黄芪及其活性成分APS、AS-Ⅳ均已研制出注射剂型，但未广泛应用于临床，不良反应也未见明确报道。因此，未来须更深入而全面地挖掘黄芪活性成分的药理作用，以期为DN的临床治疗提供更为可靠的理论依据。