影响ELISA试验检测结果的环节及试验成功的关键

郭红佳 , 普朝华

（1.新平县动物疫病预防控制中心 653400；2.新平县畜牧推广站 653400）

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），酶联免疫吸附测定，指将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。具有灵敏度高、特异性好、稳定性强、适合批量操作等特点，被广泛应用于临床医学、动物疫病诊断、食品安全检测等领域。

1 ELISA试验操作环节

1.1 试剂。试剂盒的质量直接影响检测结果的准确性，试剂盒质量不过关或者存储不当，导致试剂中抗原抗体的活性降低、失活，酶结合物浓度过高或偏低都将影响试验结果。

1.2 待检样品。常用的待检样品一般为血清（血浆），样品采集中若出现溶血、细菌污染， 很可能造成样品假阳性，影响检测结果准确性。

1.3 仪器设备。 试验前校准移液器，提前预热酶标仪，检查其能否正常工作。

1.4 操作

1.4.1 回温: 试剂盒未回温将影响检测结果的准确性。试验前需将试剂盒从冰箱取出回温至25℃，使用前各试剂充分混匀。

1.4.2 样品稀释: 样品的稀释倍数、方法，试剂盒操作说明均有严格规定，未按试剂盒说明书要求对待检血清进行稀释，或稀释液与血清混合不均匀，将影响试验检测果。

1.4.3 洗液配置: 洗涤是ELISA试验中操作次数最多的步骤，也是非常重要的一步。未严格按说明准确配置洗液，导致洗液浓度过高或偏低，造成洗板效果不佳，影响检测结果准确性。

1.4.4 加样: 加样太快，液体溅出或产生气泡；未垂直加样，液体留在孔壁；加样次序未按说明书进行；加样时间过长，板孔间反应进程不一致。

1.4.5 温育: 温育是ELISA试验的一个重要环节，必须按照说明书规定的时间、温度进行温育，实践中常采用的温育温度有室温或37℃，通常抗原抗体在37℃经过规定的温育时间产物的生成达到顶峰。封板温育时若阳性标本蒸发，会出现“花板”现象。

1.4.6 洗板: 洗板在ELISA试验中虽算不上一个反应步骤，但却决定着试验的成败，洗板的目的是为了去除反应体系中未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗板不干净易导致试验结果假阳性，而过度洗涤又会使抗原抗体洗脱，影响试验测定结果。

1.4.7 显色: 显色是ELISA反应的最后一步，底物显色一般在室温或37℃反应10～15min，显色时间、显色温度均影响检测结果的稳定性，需严格按操作规程，固定显色时间和温度。

1.4.8 读数: 显色结束后迅速加入终止液，TMB的终止液一般为叠氮钠和十二烷基硫酸钠等酶抑制剂，加入终止液后反应体系由蓝色变为黄色，应尽快在2min内通过酶标仪读取OD值，随着时间的推移吸光度值将逐渐下降，导致检测结果读数不准。

1.5其他影响因素: 试验时实验室的环境、温度、湿度亦是影响试验结果的因素。

2 ELISA试验成功的关键

2.1 试剂盒质量没问题。工作中挑选三证齐全、质量可靠的试剂盒，避免非操作因素引起的误差。

2.2 不同批号试剂盒不能混用，最好用新日期的试剂。

2.3 规范采样。样品采集过程尽可能做到无菌操作，全血的采集及血清的分离避免出现严重溶血和杂菌污染。

2.4 样品保存得当。当天检测的样品标本置于冰箱2℃～8℃保存；一星期内检测的样品于-20℃保存；超过一个月后才检测的样品超低温（-70℃）下保存。

2.5 样品成功复温。一般将样品于实验前半小时取出放置室温下自然解冻复温，样本避免剧烈震荡、摇晃，确保有效物质没有降解。

2.6 严格按说明规程规范操作，操作过程没有出现失误，样本编号没有混乱。

2.7 移液器、酶标仪定期检查校验，酶标仪参数设定准确。

3 总结

3.1 任何实验方法都要通过专业技术人员的操作完成，因此，实验室工作人员应强化质量意识，优化实验方法，提高实验操作水平。

3.2 合格的试剂、精准的仪器、优良的设备、严格的操作规程以及排除各个环节的干扰因素是保证检测结果准确、可靠的前提。

3.3 检验人员必须具备良好的职业道德和认真负责的工作态度，充分认识检测质量对于疫病诊断治疗的重要性，以高度负责的态度对待每一份检测标本，确保每一份样品的检测结果准确无误。