猪四种繁殖障碍性病毒病的研究概况

崔荣飞, 刘 冰，左晓磊，王丽娟, 张东旭

（1.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心 050041；2.河北省农业农村厅 050000；3.张家口市宣化区动物卫生监督所 075000）

随着我国经济的不断发展，养猪业的发展逐渐迈向现代化和集约化，养殖密度的加大在很大程度上会导致动物疫病的肆意传播。根据河北省动物疫病预防控制中心几年来针对本省临床猪病的监测结果，发现猪圆环病毒（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV），这四种猪繁殖障碍性病毒病的发病率情况较为普遍，疫病防控重要性比较突出，而且在临床上总是表现出混合感染的特点，对我国养殖业造成了巨大损失

1 猪四种繁殖障碍性病毒病的特点

1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，又称高致病性猪蓝耳病，患病猪只的临床症状为繁殖系统发生障碍（表现为母猪流产率高达50%～70%、公猪精子数量降低、大部分新生仔猪表现共济失调等）与呼吸系统发生障碍（表现为日常情况发生呼吸困难、咽部分泌物增多等），且因病猪呼吸困难导致患病猪只，表现耳尖呈蓝紫色，因此俗称猪蓝耳病。该病于1987年首次在美国被发现，而后在1991年科研人员在患病猪只分泌液中分离到病原，在此之后该病迅速传播到了世界各地，导致了非常大的经济损失与社会恐慌。1996年郭宝清在我国境内首次分离得到并发现PRRSV病原，从而表明了猪蓝耳病已在我国境内传播，自此至今，该病仍在我国传播与发生的速度呈上升趋势，因此于2008年，我国把猪蓝耳病加入了一类动物疫病的行列。

PPRSV是一种二十面体的卵球形正股RNA病毒，病毒最外侧是有着双层脂质结构的囊膜，其作用是作用包裹保护内部的遗传信息。而内部则是病毒的遗传物质，外部围绕有与囊膜类似的膜结构，膜表面有许多突起。该病毒感染哺乳动物（如猪、马、牛、羊、鼠和人等）时，不会凝集O型红细胞；将病毒不具有热稳定性，在56 ℃的温度下，15～20 min病毒就会失活，将病毒至于4 ℃以上的环境会令其缓慢失去感染性。通过很多测试结果表明，PRRSV在低温下有较好的稳定性，而湿度较低、温度较高的条件则会令病毒失活。PRRSV在pH小于5或大于7的环境条件下其感染力会迅速下降至10%。由于病毒有脂质结构膜的存在，则用脂溶剂等处理也会导致其失活。

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组长度约15 kb，其中共编码9个开放阅读框（ORFs），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b和ORF3～7。其中ORF1a和ORF1b比较大，占基因组的80%，这两个的作用是编码病毒的RNA聚合酶。ORF1a的终止密码子（UAG）的上游包括溴核苷酸的基因序列“UUUAAAC”。在该序列的下游包括一个伪结结构，对于ORF1b的表达是必需的。ORF2、ORF3和ORF4这三个序列的作用是编码病毒粒子相关蛋白，其表达产物分别为GP2、GP3和GP4。然而，经过大量实验表明，ORF3所表达的GP3可能会表达出非病毒粒子相关蛋白，而表达出可溶性蛋白。ORF5、ORF6和ORF7这三个序列分别编码糖蛋白GP5、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。通过查阅大量文献表明，ORF5序列可表达一种新的结构蛋白,并将其命名为ORF5a蛋白，对这种新蛋白的功能还不清楚，需要科研人员进一步的研究。M蛋白为非糖基化蛋白，其具有一定的疏水性结构。N蛋白也为非糖基化蛋白。

PRRSV传播及其迅速，患病猪只在潜伏期传播2～3个月，就可导致猪群95%以上呈阳性表达，统揽全球几乎所有的养猪企业均认为猪蓝耳病制约了养猪业的发展。根据PRRSV特征的相似性可以将该病毒分为美洲型（American type）和欧洲型（European type），虽然是同种病毒的两种分型，但它们的基因组的差异可达到40%。就现如今情况来看，PRRSV已传播到了全球较大的养猪国家，而在我国，流行最广泛的基因型为北美型。

1.2 猪圆环病毒2型

Tischer等于1974年，在猪肾细胞PK－15中观察到圆形颗粒病毒，而且该病毒在不引发病变的情况下，可持续感染细胞。Tischer等于1982年，成功分离出病毒粒子和病毒核酸，并表示该圆形颗粒物是一种有二十面体结构的无囊膜、单链环状的DNA病毒，随后将它命名为猪圆环病毒(PCV)，它是迄今为止发现的最小动物病毒。PCV共有PCV1，PCV2和PCV3三个血清型，其中PCV1未有报道发现其有致病性，而PCV2则会引起抑制免疫功能的疾病（例如新生仔猪先天性震颤等) ，进而造成并发感染或继发感染。PCV3的感染会引起母猪反制系统障碍，严重者会导致死亡。

PCV2，核酸长度1767～1768 nt。PCV在一定程度上可抵抗恶劣环境，表现在其可于酸性环境中很长时间不失活，对部分有机溶剂敏感性较低，在高温情况下也可维持一定时间不失活。但对苯酚、火碱和氧化剂等敏感性较高，25℃情况下使用甲醛消毒10min就可使病毒的活性下降。PCV不可凝结猪、牛、羊、鸡和人的红细胞。PCV2基因组共有11个开放性阅读框，其中以ORF1和ORF2序列为主，ORF1可以编码Rep蛋白，ORF2可以编码Cap蛋白，其中ORF1的基因序列相对保守。PCV1和PCV2之间因为其抗原性的不同，使得能够通过抗原交叉反应将二者进行区分。

PCV2的传播途径分为两类，分别是水平传播和垂直传播。水平传播一般是患病猪和潜伏期或治愈后的带毒猪，通过呼吸道、消化道传播；垂直传播则是患病的妊娠母猪，通过胎盘传染给仔猪。该病无明确季节性，有全球流行性，从该病的首次报道至今，在全球范围内PCV2的传播率逐年上升，在我国，集约化养殖的猪群中PCV2感染同样很严重，由此对我国的养猪业造成巨大的经济损失。

1.3 猪伪狂犬病病毒

猪伪狂犬病病毒(PRV)，也就是猪疱疹病毒I型，猪感染PRV后主要症状为体温升高、身体骚痒（除猪外）等，并会引发繁殖系统障碍等状况，严重的会导致死亡。

猪伪狂犬病病毒是一种二十面体的球形结构，由核心、衣壳、皮层以及囊膜共同组成。PRV的核心主要由双链脱氧核糖核苷酸和蛋白质所构成，并且长度大概在75 nm左右。病毒基因组的长度约为145 kb，DNA上的序列主要分为4个部分，分别是UL（110 kb）、US（9 kb）以及TR和IR两者共长16 kb，其中G+C含量约为74%。PRV基因组包含的基因达到70多个，编码的蛋白共70～100种，在所有基因中g C、g E、g G等是病毒增殖过程中所必需的，其中g E基因是制备疫苗所需的毒力基因，目前针对PRV的疫苗为g E基因敲除苗。核衣壳的长度大概在100-110 nm左右，并且由162个壳体共同构成，其中，还包含衣壳顶部的12个重复子以及150个六邻体。除去一个由多分子病毒蛋白UL6 组成的重复子外，剩下的壳体都是由蛋白质VP 5 以及VP26所构成的。由UL6 所构成的重复子的主要功能为传递病毒的遗传信息。病毒粒子的皮层可以分成三个部分，分别为内层、中层及外层，前两层结构是一种不具有特定形态的蛋白薄膜，外层由162个构成，由一个VP19c分子以及两个VP 23分子共同构成三联体，达到将162个壳粒相互连接的作用。外部为由蛋白质形成的内膜，膜上存在一些转录起始因子，VP16（αTIF false）以及能够促进病毒侵犯宿主细胞的蛋白质（vhs）。病毒的最外部分为囊膜，该膜上存在被病毒编码的糖蛋白，并且在它的表面，可以发现很多放射状的纤突，直径在10 nm左右。

猪伪狂犬病病毒在潜伏期存在的部位是三叉神经节（TG）、嗅球和扁桃体，而且在不产生临床症状的时期病毒不表现侵染性，不过在此期间可通过高度敏感的方法检测病毒核酸。经大量研究表明，在经口腔及呼吸道感染后的最初一段时间，PRV侵入该部位的上皮细胞并进行增殖，再次之后PRV就可侵入机体的感觉神经末梢。PRV能够在上皮细胞中继续繁殖，产生一系列的子代病毒。随后，子代病毒对神经元进行进一步的攻击，大大促进了神经元感染的可能性。对于上述过程经过一系列的研究后发现，PRV在首次攻击三叉神经节以及二次感染后，并不能进一步生成子代病毒，它们之间存在一定的关联性，这在一定程度上说明，病毒在对神经元感染的过程中受到一定的限制，这可以说是神经元对于多次感染而产生的一种抵抗机制，有关研究发现，上述机制主要被 PRV中的gK基因所控制的，但对该机制的表达机理尚不清楚。同时，此机制也为科研人员研究增强疫苗免疫功能打开了新的思路。根据上述机制能够进一步得出，疫苗的作用不仅可以预防感染，减毒活疫苗毒株还能够在一定程度上抑制野毒株的多重感染，进一步防止子代病毒的产生，从而可以抑制PRV的增殖和扩散。

猪伪狂犬病病毒有多类宿主，包括猪、牛、羊、猫、狗、鹿、水貂和狐狸等动物。猪伪狂犬病病毒感染宿主后，消除较为困难，猪一旦感染，不管发病与否，都将呈现带毒状态，当宿主免疫能力下降时，就会再次发病，进而感染猪群。PR对母猪和仔猪具有较大的危害，导致集约化养猪场的经济损失。该病在我国的20多个省份都有发生，但其中多数呈现散发性。

1.4 猪瘟病毒

猪瘟(CSF)指的是一累具有高危险性的接触性传染病，它的主要特点是传染性强，并且具有很高的死亡率，由一定的全球流行性，这在一定程度上对于全世界的养猪产业产生了很大的影响，我国将其列为一类传染病，猪瘟病毒(CSFV)是正股RNA病毒，长度约为12.3kb左右。在十九世纪三十年代，该病于美国的俄亥俄州被人们发现，随后便大量被世界各地所报道，现在我国猪瘟的发病率逐年上涨。患病猪只的发病情况取决于感染的毒株、患病猪只的年龄以及免疫情况等，猪只在发病后，主要表现为高热稽留、皮肤上有大量出血点，临诊上分为急性和慢性。该病还能够在一定程度上抑制机体的免疫功能，进一步使机体产生感染。

猪瘟病毒直径约为40～70 nm，核衣壳直径约29 nm，被双层脂质结构包裹，呈球形二十面体，外部有囊膜，囊膜表面可观察到有许多的纤突结构，长约6～8 nm，猪瘟病毒基因组主要由1个开放阅读框（ORF）以及2个非编码区（5’-NTR和3’-NTR)共同构成。开放阅读框（ORF）可表达出一个有3893个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白在高尔基体内加工成为四个结构蛋白和八个非结构蛋白，分别是C，E0，E1，E2和Npro，P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B,NS5A,NS5。

5’-NTR的单链间隔SS介于两个基序之间。调查研究表明，SLI和SS核苷酸的损伤会影响病毒的复制能力。C蛋白不仅是构成病毒的蛋白，而且也是调控基因表达的工具；E0蛋白含有RNase活性，它的C端能够在猪瘟病毒感染过程中，在一定程度上影响真核细胞膜的迁移，并在一定程度上可抑制RNA诱导细胞反应；E1蛋白与E2蛋白形成的复合蛋白可以帮助病毒稳定其构型。猪瘟病毒的复制时需要Npro蛋白的N端蛋白水解酶。P7蛋白可调控感染性病毒粒子的释放。NS在细胞产生CPE的过程中起到了一种媒介的作用。

猪感染猪瘟病毒，临床症状为患病猪只高热稽留，白细胞减少症，皮肤上有大量出血点等。病毒在侵袭宿主细胞时，是否能够吸附和进入细胞取决于以上四种结构蛋白，另外，CSFV是否能够成功侵入细胞还取决于细胞和组织液的PH。然而CSFV暴露于外界环境中时，对PH 和温度的灵敏性很高，在常温下若PH低于5.5或者高于9.5，就会导致猪瘟病毒灭活，而高温下，56℃ 50min 或 60℃ 10min 就会被灭活。但是，CSFV具有冷稳定性或在血液等基质中可以存活较长的时间，在4℃下可以存活6 周以上，在-80℃下可以存活多年不被灭活，在血基质中68℃ 30min依然具有感染性。常用的消毒剂可以迅速杀死CSFV，如2%氢氧化钠溶液、乙醚、氯仿等。

2 病毒检测方法的研究概况

2.1 病毒的分离

对于病毒感染进行诊断时，最好的方法是进行病毒分离。不过将病毒进行分离要花费很长时间进行观察，还要把被感染的组织和血液等接种至对病毒相对敏感的细胞系上，培养并对细胞的变化进行仔细观察，该方法需要高标准的操作环境和人员，因此多用于科研活动，在临床样本的快速诊断与检测过程中，该方法并不适用。尽管病毒分离所需的条件相对较苛刻，但该方法是对于未知疾病进行诊断之中最可靠的方法。

对猪瘟病毒敏感的细胞系主要为PK-15以及SK-16细胞系。但是经分离培养的CSFV的细胞病变，在显微镜下很难进行观察，因而需要在观察前对所观察的细胞进行免疫荧光等方法染色。

猪繁殖与呼吸道综合征病毒敏感的细胞系有Marck-145、MA-104等，而最敏感的细胞则应该是猪肺泡巨噬细胞，因其是该病毒侵袭的首要目标，所以做猪繁殖与呼吸综合征病病毒的分离也常使用该细胞。

猪伪狂犬病病毒较为敏感，即使在一般的细胞系上也能够继续繁殖，甚至能够引起病变，不过在实验室中常使用PK-15、BHK-21等细胞系来分离PRV，由于该病毒在一般的细胞系上都可增殖，所以要对分离的病毒进行确认，最直接的方法就是使用电镜，并在电镜下观察到PRV病毒粒子。经临床检测表明，临床上常见的是多病联合感染，通过上述方法将猪伪狂犬病毒分离的过程中容易出现假阳性，所以还应和其他方法结合起来检验。

在2000年，我国从患有多系统衰竭综合征病死猪的组织及血液中，首次对PCV2进行成功的分离。在实验过程中，正常会利用PK-15细胞系将猪圆环病毒2型进行分离，不过经过一系列的实验后发现，在进行增殖分离时，并未出现细胞病变的现象，这在一定程度上表明还要和其他方法联合起来，对其进行确认验证。

2.2 血清学检测技术

在抗体的常规检测与诊断过程中，常使用血清学方法主要有病毒中和试验，酶联免疫吸附试验（ELISA），血凝血抑试验以及免疫胶体金层析技术等。在进行病毒中和实验时，其操作步骤和病毒分离增殖类似，都需要进行细胞培养，所以比较耗时费力。在临床上ELISA、血凝血抑试验使用较多，尤其是酶联免疫检验试剂盒的存在，能够使检测变得更加便捷。比起前两种方法，免疫胶体金层析技术更加快速便捷，是现如今相对较为新颖的检验手段。

若想要对猪瘟病毒进行血清学检测，目前主要通过酶联免疫方法进行检验。实验者将猪瘟病毒E2蛋白和相应的抗体当做基础，进一步研究出直接和间接的酶联免疫检测手段，随后，酶联免疫吸附法被普遍应用于猪瘟抗体水平的测定。不过上述方法在检测猪瘟病毒抗体时，未表现出显著的特异性，它会在一定程度上同其他瘟病毒的抗体相互反应，导致得出的结果存在一定的偏差。

现如今，对于高致病性猪蓝耳病的感染，过去有人将高致病性猪蓝耳病病毒单克隆抗体探针作为基础，进一步研究出了针对抗原的免疫层析检测手段。该方法具有较高的灵敏度，并且它能够检测到的最低的病毒滴度为10-3TCID50/mL，该方法与常规PCR相比，在特异性和灵敏性方面不相上下，而速度却高于常规PCR。

目前针对 PCV2的感染，ORF2基因编码的Cap蛋白作为PCV2的保护性抗原，在临床上常使用Cap蛋白用作包被抗原，并以此建立相应的ELISA检测方法，而后研究人员为验证该方法的稳定性和特异性，使用Cap蛋白当做包被抗原，进一步构建酶联免疫吸附法检测手段，通过对156份猪血清进行检测后，所得出的结果均表现良好。

因为现如今针对猪伪狂犬病进行预防接种的疫苗主要是g E基因缺失苗，所以可以通过检测g E蛋白的酶联免疫试剂盒，进一步把猪伪狂犬病疫苗毒以及非疫苗毒进行区分。有关研究人员以猪伪狂犬病病毒抗体作为基础，进一步构建了磁性电化学免疫检测手段，它能够根据电极检测表，进一步对由电化学活性物质标记的抗原抗体复合物的电信号进行检测，从而得出相应的结果。即使该方法的操作相对简便，不过该方法还需进一步完善，目前还不能够被推广沿用。

2.3 分子生物学检测技术

由于目前的分子生物学技术的不断成熟，聚合酶链式反应(PCR)技术已广泛被应用在临床诊断以及疾病检测中，和病毒分离或血清学检查等方法比起来，PCR具有花费时间短、结果可靠性强、灵敏度高以及步骤简便等优点。PCR技术通过变性-退火-延伸3个基本反应阶段实现了DNA序列的体外扩增。

随着技术的不断发展，分子生物学领域的新技术不断涌现。实时荧光定量PCR（qPCR）通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，通过绘制标准曲线，计算待测样品模板的初始浓度，从而实现较为简便的定量检测。除此之外，等温核酸扩增技术在近十几年的时间里不断出现，如环介导等温扩增反应（LAMP），该方法主要是在大约60℃下进行的，操作过程不繁琐，对设备无过高要求（水浴锅即可完成），所以在该方法问世至今，已经被广泛使用在病原体的检验。LAMP方法缺点主要在反应过程中一旦开盖就容易产生气溶胶污染，导致假阳性问题比较严重。近年国内出现了一种重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification），简称RAA，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温（39℃）条件下进行核酸扩增，结合荧光即时检测，实现5～20min输出结果，灵敏度达到10copies/测试，该方法对环境温度、操作技能和实验设备要求更低，具有很大发展优势。不过上述方法最主要的问题是引物的设计方面要求比较高，有些疾病的基因可能不适合某些方法。最近，在对基因进行检测时，渐渐倾向于向微量和高通量的方向发展，其主要代表便是基因芯片技术。该方法巧妙地把现代分子生物学同微电子科学相联系，对于疾病的监测以及基因检测等多个领域具有很大的发展潜能。