雄性生殖系统中瘦素表达及功能的研究进展

金明昊，黄文一，张梦旖，张一苇，刘悦，丁之德

瘦素（leptin）是一种蛋白质类激素，主要由脂肪组织分泌，也可由脑垂体前叶、精子等非脂肪组织或细胞分泌。早在1995年，瘦素因其对能量平衡和体质量的调节功能而被发现[1]。2004年起，学者们陆续发现瘦素能促进和刺激下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴发育[2-4]。近期研究证明瘦素在雄性哺乳动物HPG轴内分泌器官、睾丸、生殖道、附属生殖腺及精子中的水平异常可导致雄性生殖系统的发育和功能障碍。我国近年来的临床研究结果显示，健康男性精浆中瘦素浓度约为0.8～1.5 μg/L，血清瘦素浓度低于10 μg/L。肥胖相关的男性不育患者精浆和血清中瘦素浓度差别较大，但两者均显著高于健康男性[5-6]。

1 瘦素的定义、结构及生物学功能

1.1 瘦素及其受体基因和蛋白结构 瘦素是由肥胖基因（ob）编码且主要由脂肪组织分泌的一种细胞因子。人类ob基因定位于染色体7q32.1，跨度约20 kb，并且仅有一个拷贝。ob基因在脊椎动物中高度保守，人和小鼠的总编码序列84%同源。瘦素蛋白是由146 个氨基酸残基构成的单链多肽，分子质量约16 ku，由4个反向平行的α螺旋（A、B、C、D）构成，其中有2个保守的半胱氨酸残基构成二硫键，对其结构稳定和生物活性至关重要[1]。

瘦素受体（LepR）是由糖尿病基因（db）编码，含1 165个氨基酸的细胞因子受体。db基因位于染色体1p31.3，其转录产物有多种拼接形式，分别翻译不同的LepR。LepR有6种亚型（LepRa～f），根据其有无胞质结构域和跨膜结构域可分为分泌型（既无胞质结构域也无跨膜结构域）、短型（无胞质结构域、有跨膜结构域）、长型（有胞质结构域和跨膜结构域）3类。其中LepRe为分泌型；LepRa、LepRc、LepRd和LepRf为短型，包含box1模体（胞内氨基酸6～17位），能够结合Janus激酶（Janus kinase，JAK），并激活其他一些信号转导的级联反应；LepRb为长型，含有JAK-信号传导与转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）结合位点，能将激活信号完全导入含受体的靶细胞[7]。

1.2 瘦素的生物学功能 瘦素在外周组织中具有多样生物活性，最早因其在肥胖和能量代谢方面具有重要作用而受到关注。瘦素可以降低动物食欲，提高能量代谢效率。瘦素及其受体基因突变可引起机体脂肪代谢障碍和内分泌缺陷，从而导致肥胖[8]。另一方面，瘦素可上调多种炎性细胞因子的分泌，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、IL-12。在非自身免疫炎症性疾病如心血管疾病、代谢性疾病中，瘦素低表达可抑制免疫系统产生不利影响，而在自身免疫性疾病中瘦素低表达可降低过激免疫反应，减缓慢性炎症的进展[9]。此外，瘦素在雄性生殖中同样发挥重要作用。

2 瘦素及其受体在内分泌及雄性生殖系统的表达

血循环中的瘦素主要由皮下的白色脂肪组织产生和分泌，也可由一些非脂肪组织产生，如脑垂体前叶；也有研究发现人射出的精子中有瘦素分泌[10]。瘦素通过与其受体结合发挥作用。不同亚型的受体在人体内分布广泛，其中与男性生殖有关的主要分布在HPG轴[11-12]、睾丸Sertoli细胞[13]和Leydig细胞[14]。

2.1 瘦素及其受体在HPG轴中表达 LepR在哺乳动物下丘脑多种神经元和内分泌细胞中广泛分布，尤其是在下丘脑弓形核（ARC）中高表达，瘦素经血循环至大脑并作用于此处的LepR，参与能量代谢的调节[15]。然而，在HPG轴调控生殖起始环节的促性腺激素释放激素（GnRH） 神经元中却无法检测到LepR；同时，也无法检测到LepR作用最重要的下游靶点磷酸化STAT3（p-STAT3）[11]。

LepR在GnRH神经元的上游神经细胞中有较多表达，如腹侧前乳核（PMV）神经元[16]、弓形核亲吻肽（Kisspeptin）神经元[17]以及GABA能神经元[18]，这些实验结果为了解瘦素对GnRH神经元的可能性作用机制提供了重要的研究方向。

垂体结节部近90%的促性腺激素细胞和远侧部30%的促性腺激素细胞有LepR表达。实验表明，垂体促性腺激素细胞在GnRH、神经肽Y、生长激素释放激素（GHRH）的刺激下会局部分泌瘦素[12]。

2.2 瘦素及其受体在睾丸与附睾中表达 小鼠睾丸组织中，瘦素及其受体主要表达于生精小管和睾丸间质[11]。在生精小管，LepR定位于生精细胞。在新生小鼠体内，小鼠睾丸中瘦素及其受体的表达部位随着小鼠睾丸的发育而发生变化：5日龄小鼠瘦素表达局限于原始生殖细胞（PGC），LepR表达于A型精原细胞；10日龄以上小鼠瘦素及其受体表达于A型和B型精原细胞。在成年小鼠体内，瘦素在生精上皮周期的第Ⅶ至第Ⅻ期表达于精母细胞，而LepR在生精上皮周期的第Ⅸ和第Ⅹ期表达于精母细胞，呈现明显的生精上皮周期特异性[19-20]。

大鼠附睾中，瘦素及其受体仅表达于亮细胞（clear cell），且实验结果显示：在蛋白水平上，瘦素及其受体在附睾头部区域表达较多，而在mRNA水平上，瘦素和其受体在附睾尾部区域表达较多[21]。

2.3 瘦素及其受体在附属腺中表达 人前列腺和精囊腺上皮的分泌细胞中存在瘦素和LepRb，提示精囊腺和前列腺可能是精液中瘦素的重要来源之一。LepR在前列腺中有较高的表达，血清中高浓度瘦素可以促进前列腺癌细胞增殖[22]。Malendowicz等[23]发现大鼠瘦素mRNA表达量在精囊腺和前列腺后叶（dorsal lobe）中较高，且各类型LepR在不同前列腺叶中含量各异。

2.4 瘦素及其受体在精子及精浆中表达 精浆中存在瘦素和游离型LepR。人精液中的瘦素至少有2种变体，以游离形式存在[24]。Jope等[25]在人精子中检测到一个LepR亚型（145 ku），该亚型可能是瘦素作用于精子的靶点，通过免疫荧光显微镜观测到其定位于精子尾部。该受体的暴露与精子膜完整性密切相关，推测精子膜完整性丢失可能会增加LepR的表达。

3 瘦素在雄性生殖中的功能及意义

瘦素在雄性生殖中发挥重要作用。肥胖伴随高血清瘦素水平与精子数量减少、活力下降、DNA碎片增加等密切相关[2]。瘦素基因敲除的雄性小鼠（ob/ob小鼠）均丧失生育能力[3]，其睾丸体积变小并伴有组织形态和生化指标的异常[4]。同时，还有研究认为血清瘦素水平与性成熟有关[26]。

3.1 瘦素通过HPG轴调节生殖系统功能 瘦素可通过HPG轴调控性腺功能。HPG轴是哺乳动物体内通过神经-内分泌系统调控性腺功能的主要途径，在促进性成熟和维持性功能方面起着重要作用。下丘脑是HPG轴的起始环节，下丘脑视前区的GnRH神经元接受相应刺激后会释放GnRH作用于垂体，垂体释放黄体生成激素（LH）和卵泡刺激素（FSH），LH和FSH可分别促进睾丸Leydig细胞合成分泌睾酮以及生精小管中的精子发生[27]。

3.1.1 瘦素作用于下丘脑 禁食期大鼠血清脂肪源性瘦素水平低下时，GnRH和LH分泌量均减少并可引起不育[28]。先天性瘦素缺乏症患者也存在促性腺激素水平低下导致的性腺功能减退[29]。STAT蛋白家族是一组可被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白，其中STAT3可以被LepR激活且磷酸化形成p-STAT3。然而，GnRH神经元中并不能检测到瘦素诱导的p-STAT3，也无法在GnRH神经元中检测到LepR。另外，GnRH细胞LepRb基因缺失也未导致小鼠生殖功能的缺陷[30-31]，因此，这些实验结果表明瘦素并不直接作用于GnRH神经元。

下丘脑的PMV中存在LepR的集中表达。实验发现瘦素干预后，高比例的PMV神经元去极化，这与瘦素作用于下丘脑视前区ARC的机制相似，该过程同样依赖于磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）。去极化的PMV神经元直接向GnRH细胞传递信号，这表明在瘦素信号转导至HPG轴过程中，PMV神经元可能具有重要的中间传递作用[16]。

Kisspeptin是已知最有效的GnRH释放诱导因子，瘦素很可能通过调节Kisspeptin分泌系统中的基因和蛋白表达，间接调节GnRH的释放。下丘脑中的Kisspeptin合成细胞主要位于ARC与前房室周围核（AVPV），然而这些区域中仅有极少Kisspeptin合成细胞能够表达LepR，这表明瘦素还可能通过某种间接途径调控Kisspeptin系统[17]。

以一氧化氮（NO）为代表的氮能系统（nitrergic system）是瘦素调节中枢神经的重要中间途径。已有实验发现，NO合成抑制剂可以阻断瘦素对ARC中Kisspeptin mRNA表达的作用，而在AVPV中几乎无影响，这表明瘦素对中枢神经的作用至少部分是由氮能系统介导的[28]。位于PMV表达LepR的神经元投射到AVPV和ARC，可能参与瘦素对Kisspeptin分泌系统的间接作用。PMV中存在大量NO合成细胞，而正常条件下，细胞内NO的合成依赖于神经元型一氧化氮合成酶（nNOS）。瘦素干预后，PMV中nNOS和LepR的下游靶点p-STAT3共表达，这进一步表明NO介导了瘦素对Kisspeptin分泌系统的调节作用[32]。

表达LepR的神经元中有一部分是GABA能性（释放神经递质GABA的神经元），尤其是ARC中的LepR神经元，可占10%～45%。从GABA能神经元中敲除LepRb会导致严重的肥胖和代谢功能障碍；同时，该敲除小鼠还呈现生殖功能受损[18]。因此，此项研究表明小鼠正常生育力的维持也需要GABA能神经元中瘦素信号的传导。

3.1.2 瘦素作用于垂体 瘦素能够直接作用于垂体前叶发挥自分泌和旁分泌作用。在男性体内，垂体瘦素主要来自于生长激素细胞（somatotropes），可通过激活促性腺激素细胞（gonadotroph）中的NOS促进LH释放，并促进少量FSH释放。实验证实NOS完全抑制剂可在大鼠垂体水平上抑制瘦素诱导的LH释放[33]，但瘦素在垂体水平的具体作用机制还有待进一步阐明。

3.2 瘦素影响睾丸细胞结构及附属腺功能

3.2.1 瘦素作用于Sertoli细胞 首先，瘦素可以通过调节Sertoli细胞中的糖代谢抑制生殖细胞的发育。Sertoli细胞从血液中吸收葡萄糖，其中大多数被代谢为丙酮酸，在乳酸脱氢酶的催化下转化为乳酸，发育中的生精细胞优先利用乳酸。高水平瘦素可降低人睾丸Sertoli细胞的葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）水平和乳酸脱氢酶活性，抑制Sertoli细胞对丙酮酸的摄取与代谢，从而阻止生殖细胞的发育[3]。

其次，瘦素可通过调节Sertoli细胞中的乙酸代谢影响生精细胞的发育。Sertoli细胞在自身代谢中会产生大量的乙酸，它们是精子形成过程中合成脂质的重要碳源。病理性高水平瘦素可明显降低Sertoli细胞乙酸的产量，从而阻止生殖细胞的发育[3]。

另外，瘦素可能通过损害血睾屏障（blood-testis barrier）而引起男性不育。Sertoli细胞间的紧密连接是构成血睾屏障的主要结构，血睾屏障可防止某些物质进出生精上皮，从而维持精子生长发育的微环境。过量外源性瘦素可降低小鼠Sertoli细胞中紧密连接相关蛋白的表达，从而干扰血睾屏障的完整性[13]。

3.2.2 瘦素作用于Leydig细胞 Leydig细胞的主要功能是合成和分泌雄激素。雄性哺乳动物血清中90%以上的睾酮由Leydig细胞分泌。有研究表明，肥胖男性的血清睾酮水平与脂肪量呈负相关，可能与瘦素抑制Leydig细胞合成和分泌睾酮有关[34]，但值得注意的是，瘦素本身不能直接影响Leydig细胞的合成和分泌功能，而是通过降低LH和人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平，抑制这些激素诱导Leydig细胞合成和分泌睾酮[14]。

3.2.3 瘦素作用于前列腺和精囊腺 人前列腺和精囊腺上皮可能是精浆瘦素的来源之一。前列腺和精囊腺中的瘦素进入精液后，加速精子胆固醇外排和蛋白酪氨酸磷酸化，从而促进精子成熟。另外，瘦素作为有丝分裂原和抗凋亡因子，可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K途径促进前列腺癌细胞的生长，并且还可刺激前列腺癌衍生细胞系的增殖、迁移以及分泌生长因子等。因此，高瘦素水平可被认为是前列腺癌发生和转移的一个危险因素[22]。

3.3 瘦素对精子发生和成熟的影响

3.3.1 精浆中瘦素的来源及作用 Glander等[35]发现输精管切除术患者每次射精的瘦素量无明显变化，精浆瘦素浓度与血清瘦素浓度无相关性，且显著低于血清中瘦素浓度，这提示精浆瘦素可能仅来源于雄性生殖道。Camiña等[24]比较40例健康男性和5例输精管切除男性精浆瘦素水平后发现两者差异无统计学意义。因此认为睾丸组织不是精浆瘦素的来源，其最可能的来源是精囊腺或前列腺组织。

精浆中的瘦素参与精子运动力发育的过程。当精浆中瘦素浓度相对较低，瘦素对精子形态和运动无负面影响，而瘦素浓度较高时，精子的数量和活力都与瘦素浓度呈负相关，推测较低浓度瘦素有维持或促进精子运动能力的作用。

3.3.2 瘦素导致生精细胞内氧化应激产生

3.3.2.1 瘦素增加精子活性氧簇（ROS）水平 已有研究表明，瘦素可引起精子所处环境的ROS水平增加。瘦素处理后，精子表达8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）水平升高[36]，这是细胞DNA氧化损伤检测中最常用的生物学标志物之一。

瘦素可直接作用于生精小管上皮细胞线粒体，通过影响线粒体外膜通透性，使线粒体跨膜势能耗竭，增加ROS产生。另一方面，瘦素处理后，线粒体中电子传递链相关酶表达显著上调，而抗氧化酶、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、过氧化物酶1（Prdx1）和谷胱甘肽S-转移酶pi 1（Gstp1）的表达均下调，最终可导致ROS的增加和氧化应激水平的提升[36]。

另外，瘦素还可通过与瘦素作用相关的途径[腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、PI3K、MAPK和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路]发挥作用[37]。Md Mokhtar等[38]发现PI3K途径抑制剂LY294002能减少瘦素对精子的负面影响，但AMPK途径抑制剂却见效甚微。

3.3.2.2 瘦素抑制精子ROS防御系统 瘦素引起氧化应激损伤的另一因素可能是瘦素抑制了抗氧化防御系统。瘦素处理的大鼠生精细胞其组蛋白-鱼精蛋白的过渡受到损害。精子形成过程中，组蛋白被鱼精蛋白取代是保护精子DNA的一个重要过程。经瘦素处理后，组蛋白被鱼精蛋白替代不足，染色体DNA无法紧密包装，因此，容易受到ROS的攻击、增加DNA断裂的可能性，而该过程可能通过下调鱼精蛋白基因的表达实现[39]。

此外，组蛋白乙酰化在精子发生中也起着重要作用。瘦素能够加速组蛋白乙酰化，使染色质结构松散，更容易受到破坏，从而加大DNA损伤和断裂的风险[39]。

3.3.3 瘦素在精子获能中发挥重要作用 Aquila等[10]发现精子在获能过程中可伴随着瘦素的分泌量增加，提出瘦素可能在精子获能中发挥重要作用。瘦素可触发STAT3信号转导路径，诱导PI3K和MAPK通路及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病2（BCL-2）的激活，从而增强精子的获能指数和顶体蛋白酶活性[40]。研究发现瘦素处理后未获能精子的胆固醇外排水平增加，这是获能过程的启动过程；蛋白酪氨酸磷酸化水平也会增加，这可以用于评价获能的进度[10]。

另一方面，瘦素也会通过影响糖原合成酶活性，负向调节精子的获能过程。糖原积累可为精子获能提供能量。在未获能精子中，瘦素会通过蛋白激酶B（Akt）途径显著降低糖原合酶激酶3S9（GSK-3S9）的磷酸化水平，下调糖原合成酶活性，从而降低糖原合成效率[10]。由此可见在生理状况下精子获能过程，瘦素浓度升高有利于获能进展，而当瘦素浓度异常增高时可使精子获能过程减缓或终止。

4 结语与展望

综上所述，瘦素通过作用于HPG轴、睾丸组织Leydig细胞和精子对男性生殖系统发挥作用。其中，瘦素通过HPG轴的激素调节促进Leydig细胞合成分泌睾酮以及生精小管中精子的发生，在小鼠中体现为与性成熟调控有关。睾丸组织中，瘦素直接作用于Sertoli细胞和Leydig细胞，调节Sertoli细胞中乳酸的代谢，影响Leydig细胞分泌雄激素。对于精子，瘦素主要影响其发生、成熟和获能过程。一方面，瘦素既可以诱导ROS的生成从而增加睾丸组织和生精细胞的氧化应激；另一方面也可降低生精细胞对ROS的抵御能力，最终造成生精细胞的损伤；此外，瘦素还能通过参与精子能量底物糖原的积累和STAT3信号途径调节精子的获能。

然而，瘦素间接作用于下丘脑GnRH神经元的确切机制还尚未完全明了，目前部分学者将目光投向瘦素作用于下丘脑参与机体代谢调节的神经转导通路，探究其对生殖系统的影响。另外，瘦素及其受体在Sertoli细胞中的表达量较少，瘦素是否通过影响Sertoli细胞的功能从而影响精子发育也有待进一步研究。