兽医生物制品中常用灭活剂和冻干保护剂研究进展

赵成龙，王素春，庄青叶，3，李 阳，潘子豪，孙瑞妮，张富友，5，肖志宇，，梁晚枫，孙福亮，汪 洋，黄禹丰，，陈海燕，，刘华雷，王楷宬，7

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.延边大学，吉林延吉 133000；3.山东畜牧兽医职业学院动物医学院，山东潍坊 261061；4.南京农业大学，江苏南京 210095；5.山东农业大学，山东泰安 271018；6.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023；7.青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114）

灭活剂是指能致死细菌或病毒，使其失去复制能力和/或致病力（毒力）的化学物质。微生物学意义上的灭活有两层含义：一是指破坏或杀死微生物，使其成为没有生物物质的过程；二是指使一些活性物质（微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等）失去活力的过程。生物制品意义上的灭活是指利用物理或化学方法，破坏微生物生物学活性，使其丧失繁殖能力和致病能力，但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。

冻干保护剂是指冷冻真空干燥的生物制品中抗原活性物质以外的添加物，其作用是防止制品在冻干过程中活性物质失去结构水，阻止结构水形成结晶，以保护微生物活性物质的活性与抗原性，降低细胞内外渗透压，保持干燥状态下弱毒疫苗微生物的活力。保护剂既有生物学作用，也有物理学效应。

灭活和冻干对生物制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、稳定性和保存期影响较大。不同灭活和冻干技术的原理并不同，需根据微生物类型和制备目的，针对性选择适用的灭活剂和冻干剂。本文主要以禽流感病毒等研究内容为例，综述了目前兽医生物制品制备过程中常用灭活剂和冻干剂的研究进展。

1 灭活剂

常用的灭活剂有β-丙内酯、甲醛、烷化剂、Trizol 试剂等。对于生物制品的制备，在灭活剂的选择上应多方面考量，根据灭活原理和制备目的，尽可能选择适用的灭活剂。

1.1 β-丙内酯

β-丙内酯（β-propiolactone，BPL）对病毒有较强的灭活作用，其作用机制不是直接作用于壳蛋白，而是通过改变微生物核酸结构达到灭活的目的。大剂量BPL 是一种潜在的致癌物，但其极易水解。BPL 灭活周期短，经济效益高，但相较甲醛价格较高；对病毒有较强的杀灭作用，低质量浓度的BPL（2～4 mg/L）可以破坏病毒核酸，但不改变病毒蛋白质。试验结果[1]显示：BPL 对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的最佳灭活条件为1:3 000 灭活24 h，或1:1 000 灭活18 h；对H9N2亚型AIV 灭活能力强，对血凝素（hemagglutinin，HA）效价影响小，易水解成无害无残留产物；分别以BPL、甲醛为灭活剂制备H9N2 亚型AIV 灭活疫苗，免疫SPF 鸡和广西土鸡，其免疫效果接近。

1.2 甲醛

甲醛对微生物核酸和蛋白都有破坏作用。甲醛可与核酸中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等含氨基碱基结合，使微生物核酸变性；与微生物蛋白的氨基结合形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，后者与酰胺交联，使微生物蛋白变性，从而阻止其核酸逸出。甲醛灭活微生物也存在一些缺点：作用于病毒壳蛋白时，容易与酰胺交联形成屏障而使作用于核酸的效率下降，导致灭活周期较长；灭活效果容易受到温度、pH、微生物种类、浓度的影响；具有致癌性，会使机体产生刺激反应。甲醛对单链核酸最有效，因此常被用来灭活RNA 病毒。适当浓度的甲醛可使被灭活微生物的抗原性和血凝性保持不变。陈慧婧等[2]进行了AIV 灭活试验，发现用0.1%的甲醛灭活AIV 16 h 后，病毒全部死亡，18 h为最佳灭活时间。

1.3 烷化剂

烷化剂主要包括二乙烯亚胺（binaryethylenimine，BEI）、乙酰基乙烯亚胺（acetylethyleneimine，AEI），是常用灭活剂，化学性质活泼。其灭活机理是使核酸中的腺嘌呤和鸟嘌呤烷基化，导致核酸单链断裂和双螺旋键交联，从而干扰核酸合成，抑制其复制。烷化剂可以与蛋白质相互作用，破坏蛋白质高级结构，使病毒完全丧失传染性，但不损伤表面结构蛋白，从而保留其抗原性，因此是制备灭活病毒疫苗的良好灭活剂。目前，用BEI 灭活制备的疫苗已使用于动物中，尚未在动物体内发现BEI 残留。烷化剂作为灭活剂，对生产成本、保存条件要求较高，对细菌灭活效果一般。国内外专家[3-5]分别使用BEI 和甲醛对流感病毒进行灭活，通过血凝、RT-PCR 和免疫扩散法检测，发现BEI在灭活流感病毒感染性的同时，能够较好地保持病毒的抗原性。

1.4 Trizol 试剂

Trizol 试剂由苯酚和异硫氰酸胍组成。其灭活机制是使微生物蛋白质变性，抑制脱氨酶、氧化酶等酶系统活性，从而导致微生物死亡。几十年来，使用Trizol 试剂灭活病毒已成为研究人员普遍采用的方法[6]。2018 年，李瑜霞等[7]用Trizol 灭活甲型流感病毒阳性样品并比较其差异，发现灭活后的样品变异系数较小，灭活稳定性较好；经过40 次反复冻融，样品中依然可以检测到病毒核酸，对核酸保护效果好；应用Trizol 灭活甲型流感病毒制备的质控样品，在热稳定性、保存期、稳定性和适用性等方面都具有较好的表现。目前，使用Trizol 试剂灭活微生物尚未发现其不足之处，具有广阔的研究前景。

1.5 聚维酮碘

聚维酮碘是一种常见的生物灭活剂，常用于皮肤黏膜杀菌。也有研究将其用于病毒灭活：王玲等[8]用此消毒液灭活脊髓灰质炎病毒，发现所需剂量比灭活细菌和真菌的剂量高10～50 倍，原因可能是聚维酮碘对微生物核酸物质作用较差；刘梅等[9]通过试验证明，聚维酮碘溶液消毒剂对基因VII 型NDV 具有良好的灭活效果；计慧琴等[10]通过鸡胚感染试验和Klein-Defors 悬浮灭活试验，证明聚维酮碘灭活H3N2 亚型猪流感病毒的最佳质量浓度为2%。

1.6 双氧水

有包膜的病毒对双氧水灭活较为敏感，1.5%双氧水在1 min 内可使流感病毒全部灭活[11]。双氧水具有价格低、灭活周期短、对病毒表面蛋白结构破坏较小等优点。有研究[12]表明，相对于传统的甲醛灭活，双氧水灭活对病毒表面蛋白结构破坏较小，灭活后的病毒具有良好的免疫原性，可诱导产生更高水平的保护性抗体。使用双氧水已成功制备日本脑炎病毒灭活疫苗[12]。目前关于双氧水用作灭活剂的研究较少，但它仍是一种潜在的灭活剂。

1.7 过硫酸氢钾复合盐

过硫酸氢钾复合盐是一种新型过氧化物灭活剂，具有广阔的应用前景。其灭活机制主要是利用氧化作用破坏微生物的生物膜屏障，干扰核酸复制，使蛋白质凝固变性，从而灭活微生物，具有广谱、高效、安全、无残留等优点[13]。张玉霞等[14]研究表明，质量浓度为313 mg/L 的过硫酸氢钾溶剂，可在短时间内使H9N2 亚型AIV 全部灭活。

2 冻干保护剂

微生物冻干后存活率降低的最主要原因是冻干过程中冰晶的形成，由于细胞内溶质浓度高，引起渗透压增高，导致微生物细胞膜破坏。此外，冻干破坏了亲水性大分子结构，导致部分蛋白质受到破坏，最终影响了微生物存活率[15]。为减少冻干对病毒的影响，需要加入合适的保护剂，以减少或避免外部恶劣环境对其造成破坏，防止干燥或者复水对病毒的损坏。冻干保护剂技术是保证生物制品稳定的关键技术，它不仅为生物制品的冷链运输和贮藏提供了便利，还可提升疫苗效力。冻干保护剂的主要作用机制：（1）将病毒冻结，使其中冰晶升华，从而达到低温脱水，防止活性物质流失结构水的目的，以降低对生物活性的影响；（2）降低胞内外渗透压差，维持细胞活力；（3）保护或提供病毒恢复所需营养物质，使活性物质自我修复。在选择冻干保护剂时，要考虑保护核衣壳结构蛋白结构和核酸稳定性[16]。

常用的冻干保护剂有糖类、氨基酸、蛋白质和大分子明胶等。碳水化合物和蛋白质是生物制品相关研究中最为常见的两种保护剂[17]。对多品种生物制品分析发现，因微生物（或抗原蛋白）结构特点各不相同，适用于它的冻干保护技术也不同，所以没有一种通用于各种生物制品的“万能”保护剂。

2.1 糖类保护剂

糖类在微生物冻干过程中的保护作用机制有两种假说：一是糖类的羟基在干燥和脱水过程中与蛋白质的极性基团形成氢键，进而取代蛋白质上的水分子，形成一层水化膜，防止氢键暴露，从而稳定蛋白质的高级结构，维持病毒的抗原性；二是含糖溶液在冻干过程中会玻璃化，而糖类所处的状态为玻璃态。在玻璃态下，糖类保护剂黏度较高，分子扩散系数较低，因而会将蛋白质分子包裹，形成一种碳水化合物玻璃体，从而维持了蛋白质分子结构，起到保护作用[18-19]。研究[20-21]表明：（1）单糖中，半乳糖的保护效果最佳；（2）二糖的保护效果普遍较好；（3）三糖中的棉子糖对细菌的保护作用最好。Costa 等[22]对成团泛菌（Pantoea agglomerans）研究表明，海藻糖和蔗糖用作保护剂时效果最好，当使用50 g/L 的海藻糖时，菌群存活率达到83%左右，当使用100 g/L 的蔗糖时，存活率达到75%左右。此外，海藻糖分子较小，能填补蛋白质分子的空隙，有效限制蛋白质分子内部结构变化，从而起到保护病毒蛋白外壳的作用[23]。

2.2 氨基酸保护剂

在冷冻过程中，低浓度的甘氨酸可以抑制由于磷酸缓冲盐结晶所致的pH 变化，并防止蛋白质变性。结晶型甘氨酸的主要作用是提升冻干品的塌陷温度，防止破坏蛋白质结构。常见氨基酸保护剂主要包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸钠、色氨酸、酪氨酸[24-25]。王颖等[26]研究发现，2%谷氨酸钠、2% L-精氨酸盐酸盐、2%D-山梨醇、7.6%酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明胶、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方，可使猪伪狂犬病病毒冻干保护率达到80.40%。

2.3 蛋白质保护剂

蛋白质保护剂主要包括脱脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白，其能够阻止病毒蛋白质表面吸附，从而对冻干过程中多数蛋白都能起到保护作用。此外，蛋白质可以在微生物细胞外形成保护，在冷冻干燥过程中，蛋白质溶液中的保护剂与蛋白质分子之间相互作用，增加冷冻混合物的玻璃化转变温度，大大增加微生物蛋白质的稳定性[21，27]。采用质量浓度为10.49%脱脂乳与4.22%葡萄糖混合后冻干副干酪乳酸菌，当冻干厚度为0.3 cm 时，菌体细胞存活率最高，达到94.90%[28]。

2.4 明胶保护剂

在冻干生化过程中，大分子物质（如明胶、蛋白胨、果胶等天然混合物）促进形成耐热的骨架，从而有效阻断热辐射和热传导，这种构架能增强对病毒的耐热保护作用。我国大部分兽用冻干活疫苗，根据生产工艺和保存条件不同，可分为常规保护剂活疫苗和耐热保护剂活疫苗。用于疫苗生产的明胶要去掉杂质蛋白，使其无抗原性、无过敏反应、无热源，其分子质量小、均质、易溶于水，对微生物的保护作用要高出普通明胶10%以上[29]。韩志玲等[30]研究发现，选用20%蔗糖、10%明胶冻干保护剂，与菌液以1:6 的体积配比混合，再加入终质量浓度约1%的硫脲，制备布鲁氏菌活疫苗（Rev.1 株），冻干前后活菌数损失比例小于5%。李星等[31]研究发现，明胶不仅可以增加黏性，使冻干品形成良好的外观状态，还可以增加抗原的稳定性。

3 展望

灭活和冻干是兽医生物制品生产中必不可少的技术之一。目前，我国大部分生物制品主要使用甲醛灭活。该方法技术成熟，价格低廉，但使用甲醛作灭活剂存在破坏免疫原性、有致癌风险、灭活时间长等问题[32]，难以适应新型疫苗发展。虽然新型灭活剂研究也已逐步开展，但大多仍局限于实验室研究阶段。未来需要研制新型灭活剂，以增强灭活疫苗的免疫力，减少疫苗的毒副作用，并将新型灭活剂的安全性、有效性、选择性和可控性有机结合[33]。

冻干工艺技术直接影响生物制品的保存、运输和使用。由于不同保护剂的保护机制各不相同，单一保护剂不能满足微生物抵抗恶劣环境的需求，因此在冻干过程中常采用不同类型的保护剂，按照合适的浓度配比进行协同保护，从而强化保护效果，保证微生物存活率最大化。未来既要开发常温冻干保护剂，也要开发稳定的液态保护剂[34]。