新旧版国家标准《高致病性禽流感诊断技术》血凝和血凝抑制试验内容比较

张智瑜，袁 凯，徐秀荣，王慧敏，兰邹然

（1.淄博市动物疫病预防与控制中心，山东淄博 255000；2.山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250100）

高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）是严重威胁全球养禽业健康发展的禽病之一，为此世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病[1-2]，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。2004 年开始，我国对H5 亚型HPAI 实施强制免疫，并要求开展免疫效果评估[3]。2020 年以前，开展免疫效果评估主要根据《高致病性禽流感诊断技术》[4]（GB/T 18936—2003，以下简称“旧版标准”）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验，并结合《国家动物疫病监测方案》要求进行，但旧版标准对某些内容阐述不清。2020年12 月14 日，国家市场监督管理总局和国家标准化管理委员会联合发布了新版《高致病性禽流感诊断技术》[5]（GB/T 18936—2020，以下简称“新版标准”），内容较旧版标准有所变化。本文中，笔者对新、旧版标准HA 和HI 试验进行比较分析，以期为广大兽医实验室检测人员更好地理解新、旧版标准差异以及新版标准优点，从而提高试验结果准确性提供参考。

1 新旧版标准主要不同之处

1.1 新版标准HI 试验增加了4 HAU 抗原配制的验证内容

旧版标准HI 试验3.2.2.1 中，只对4 HAU 抗原如何稀释进行了阐述，但对如何验证配制是否准确并没有介绍。直接根据HA 试验结果进行4 HAU 抗原配制，使HI 试验结果存在一定不准确性。在新版标准发布之前，检测人员通常根据试验原理开展“回归试验”验证4 HAU 抗原准确性。尽管“回归试验”能有效验证4 HAU 抗原准确性，但旧版标准中并无明确阐述。

新版标准HI 试验7.4.1 中，增加了对4 HAU抗原配制的验证内容，而且要求对4 HAU 抗原进行系列稀释，可根据检测结果进行抗原效价调整，这大大提高了4 HAU 抗原配制的精确性和最终结果的准确性。根据新版标准7.4.1 示例“血凝的终点滴度为1:256（28或8log2）”，4 HAU 抗原系列稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 及1:7，这样能很大程度地避免抗原效价落入29和210之间的配制困惑。如果配制的抗原液是4 HAU，则1:2、1:3、1:4 稀释度会出现100%凝集，1:5、1:6、1:7稀释度会出现泪珠样流淌，因此1:4 稀释度即为凝集终点。如果凝集终点没有落在1:4 稀释度，则代表配制的抗原液不是4 HAU。因为配制4 HAU抗原液体积比为1:64（256/4=64），如果凝集终点落入1:5 稀释度，则血凝的终点滴度为1:320（64×5=320），配制4 HAU 抗原液体积比则应改为1:80（320/4=80）。

新版标准7.4.1 示例中给出了4 HAU 抗原配制和验证的操作方法，但对刚接触该试验的实验室操作人员来说比较抽象，难以理解。因此笔者所在实验室相关人员对该试验进行了实操分析，并对操作过程进行了通俗易懂的阐述。具体为：

第1 步：在96 孔V 型微量反应板第1 排第1孔加入0.020 mL PBS，第2～6 孔依次加入0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 mL PBS。

第2 步：在第1 排第1 孔加入4 HAU 抗原0.020 mL，第2～6 孔各加入4 HAU 抗原0.010 mL。

第3 步：从第1 排的第1～6 孔各吸取0.025 mL加至第2 排相应孔中，此时第2 排第1～6 孔抗原稀释度依次为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。

第4 步：第2 排第1～6 孔加入0.025 mL PBS。

第5 步：第2 排第1～6 孔加入1%鸡红细胞悬液0.025 mL。

第6 步：室温（约20 ℃）放置40 min 或4 ℃放置60 min，进行结果判定。

1.2 新版标准HI 试验增加了鸭、鹅水禽血清预处理内容

某些禽类（尤其是水禽）血清，在HI 试验中可能呈现非特异性凝集现象。稀释度低的孔出现凝集，而稀释度高的孔出现泪珠样流淌，和正常结果相反，从而干扰试验人员对结果的判定。

针对禽类血清的非特异性凝集现象，新版标准7.4.3 提到了“鸭、鹅血清在检测时建议进行预处理”，且专门在附录C 里说明了血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法。检测人员可以参考附录C.1 中处理方法对可能产生非特异性凝集的血清样品进行预处理。

根据笔者多年开展HA 和HI 试验操作的经验，并不是所有水禽血清都出现非特异性凝集现象，试验人员可以根据具体情况来确定是否需要对样品进行预处理。当实验室大批量检测水禽血清样品时，可以先按常规操作开展试验，结果判定发现有非特异性凝集的，再单独挑出相应血清样品按照附录C.1 方法进行处理，然后对该样品重新进行HI 试验；当实验室检测少量水禽血清样品时，可以将所有样品先做HA 试验，如果待检样品出现红细胞非特异性凝集现象，则说明样品中有非特异性凝集因子存在，选取相应样品再按照C.1 方法进行处理操作即可。

1.3 新版标准HI 试验增加了“用于检测抗体”的结果判定，并在“用于检测抗原”方面，把HI效价1:16（24 或4log2）判定为阳性

新版标准HI试验7.4.6结果判定中，增加了“用于检测抗体”的结果判定，丰富了该标准HI 试验的检测用途，既可以检测抗原，又可以检测抗体。

旧版标准HI 试验3.3 结果判定中，HI 效价为4log2 时判为可疑，需进行重复试验。新版标准HI 试验7.4.6 结果判定中，则改为HI 效价不低于4log2 时均判为阳性。相比旧版标准，新版标准省去了重复试验，大大缩短了检测时间。

此外，旧版标准3.3 结果判定中，HI 效价只用log2 来表示，而新版标准7.4.6 结果判定中HI效价可以用1:16、24、4log2 3 种方式来表示，更便于试验结果记录。

1.4 新版标准HA 试验结果判定中，增加了对反应板倾斜角度的阐述

旧版标准HA 试验3.2.1.7 结果判定中，仅描述为“将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌”。在新版标准发布之前，试验人员往往通过个人习惯倾斜反应板以方便读取结果。新版标准7.3.6 结果判定部分对反应板倾斜角度进行了明确阐述：“判定时，将反应板倾斜60°（此处原文为℃），观察红细胞有无泪珠状流淌”。这可以使试验人员有据可依，确保了结果判定的准确性。

2 新版标准存在的错别字问题

新版标准HA 试验7.3.6 结果判定中，有“判定时，将反应板倾斜60 ℃”的描述。错将几何单位的度（°）写成了温度单位的摄氏度（℃），建议修订为“判定时，将反应板倾斜60°”。

3 小结

HA 和HI 试验是目前我国对HPAI 免疫抗体评估的主要手段。整个试验过程难度不大，但是步骤繁琐，如果操作不规范，将会影响整体试验结果。同时，新、旧版标准发布时间间隔长达17 年之久，在新版标准出台之前，旧版HA、HI 试验操作标准不能完全满足实际检测要求。HI 试验中，4 HAU抗原配制和验证是该试验能否成立的关键所在，新版标准对4 HAU 抗原的配制验证进行了补充，这提高了抗原配制的精确性，从而确保了最终结果的准确性。本文总结提炼了新版标准中4 HAU 抗原配制和验证的操作方法，使得整个操作过程更为简单易懂，便于试验人员理解掌握。

此外，新版标准增加了鸭、鹅水禽血清的预处理，避免了HI 试验中非特异性凝集现象的出现，确保结果更加准确；新版标准规定，HI 效价不低于4log2 时均可判为阳性，因而减少了重复试验，提高了检测效率；新版标准中HI 效价的表示形式更加多样化，可以用1:16、24、4log2 3种方式来表示，在结果记录时更加人性化。但是，新版标准7.3.6中错将几何单位的度（°）写成温度单位的摄氏度（℃），提示标准制定时应该更加严谨，注意细节，及时更正存在的不足之处。

新版标准的发布实施，使得HPAI HA、HI 试验在操作步骤上更精准详细，在结果判定上更科学准确，弥补了旧版标准存在的诸多不足。它使试验人员更加有标准可依，有步骤可循，提高了试验流程的规范性，为进一步指导HPAI 防控提供了技术支撑与标准依据。