“通督启神”针法治疗阿尔茨海默病的动物实验研究进展*

刘 浩，姜 婧，史术峰,汪子栋，田会玲，王 顺，任菁钰，杨佳一，李志刚△

(1.北京中医药大学,北京 100029; 2.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029)

“通督启神”针法由李志刚教授首次提出，根据《素问》《灵枢》《难经》《金匮要略》等记载，结合临床实践提出“督脉-脑-神”一体化系统，以“通督”为手段，达“启神”之目的，广泛用于治疗各种与“脑”相关的多种中枢神经系统疾病,如阿尔茨海默病、抑郁症和脊髓损伤等[1]。根据其连接的不同仪器，可分为“通督启神”手针、“通督启神”脉冲电针和“通督启神”音乐电针。具体操作为(实验小鼠)：选取“人中穴”向鼻尖方向快速点刺，不留针；点刺结束后，取“百会穴”向下、“印堂穴”向上平刺进针，进针深度为0.5 cm，胶带固定,针刺过程中每隔5 min行90°小幅度捻转，20 min/次，每日1次，共15 d。而后提出“通督启神”脉冲电针，针柄连接韩式电针仪，疏波，频率为2 Hz，电压为2 V，电流强度为0.1 mA，强度以小鼠头部微颤为宜。由于脉冲电针发出的是周期性重复波形，在治疗后期出现机体耐受而疗效衰减。因此，在脉冲电针的基础上，针柄连接ZJ-12H型音乐电针治疗仪，选用健脑益智类音乐处方，组成“通督启神”音乐脉冲电针。为探究“通督启神”针法治疗阿尔茨海默病(AD)的现代生物学机理，团队进行了一系列动物实验，并取得了一定的研究进展。本研究整理其团队近5年研究“通督启神”针法治疗AD的实验研究文献，综述如下。

1 脑能量代谢和脑血流量

1.1 提高脑的能量代谢

大脑是人体能量代谢最丰富的器官。平均而言，成年人的大脑只占总体重的2%。然而，在静息清醒状态下，其接收约15%的心输出量，利用约20%的身体总耗氧量和25%的身体总葡萄糖。生理条件下，葡萄糖是成人大脑必需和主要的能量底物，而AD患者大脑皮质的神经元出现变性、丢失和萎缩，伴有葡萄糖代谢降低[2]。其认知功能损害在一定程度上是由于海马区对葡萄糖的摄取率低所致，反复的低血糖发作会增加AD患病风险，而向大脑的特定区域增加葡萄糖的可利用性可以积极地调节认知功能，如在动物实验中，向海马、纹状体、杏仁核和内侧隔核显微镜下注射葡萄糖可增强大脑记忆加工功能[3]。研究表明，脑内葡萄糖代谢受损，尤其是硫胺代谢和胰岛素抵抗的改变，可促进Aβ积累和Tau过度磷酸化，加重神经退行性变和突触的缺失[4]，并可诱发多种致病因素，如线粒体功能障碍、氧化应激、炎症因子、兴奋性中毒、细胞凋亡和蛋白激酶过度激活，这些协同作用于AD患者大脑，造成病理功能障碍[5]。

FDG-PET(Fluorodeoxy glucose positron emission tomography，FDG-PET)可实时观察大脑各部位葡萄糖代谢的功能状态，已经被列为AD的诊断标准[6]。课题组通过小动物FDG-PET技术，研究发现“通督启神”脉冲电针法可明显提高SAMP8及APP/PS1小鼠的大脑皮层(额叶、颞叶、顶叶)和海马神经元的葡萄糖代谢水平，改善其空间学习和记忆能力，其疗效作用优于胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐[7-10]。而后进一步研究发现，在提高皮层、额叶和海马葡萄糖摄取率方面，“通督启神”脉冲电针疗法联合多奈哌齐治疗AD效果更佳[11]。

1.2 脑血流量

大脑葡萄糖代谢的重要性不言而喻，但脑的糖原储存量只有0.1%，仅够维持大脑几分钟的正常活动，脑组织主要依靠循环血液不断供给葡萄糖以维持其正常功能。

脑血管功能受损是AD发病的关键环节[12-13]。研究表明，AD患者早期脑血流量显著降低[14]，脑血管信号网紊乱及神经血管损伤可造成脑灌注量减少[15]，导致中枢缺血缺氧，直接造成神经元损伤，启动神经退化进程，促进神经元Tau蛋白磷酸化及APP表达提升，上调脑内β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)水平[16]，导致认知功能受损[17-18]。

在功能方面，团队成员丁宁采用动脉自旋标记(ASL)结合磁共振成像技术观察SAMP8小鼠海马及前额皮层脑血流量，研究结果显示：“通督启神”脉冲电针法能够显著提升SAMP8小鼠海马及前额皮层脑血流量，良性调节认知相关脑区灌注，防止神经元损伤，减轻Aβ沉积，延缓神经退化进程，保护认知相关脑区功能的完整性，从而改善认知功能[19-20]。而在脑血管结构方面，课题组加吾拉等采用透射电镜结果显示，“通督启神”脉冲电针法能保护APP/PS1小鼠海马微血管的结构功能[21]。

综上所述，团队通过FDG-PET和ASL-MRI技术，在活体状态下，证实“通督启神”针法能够显著提升AD小鼠海马及前额皮层脑血流量，改善其葡萄糖摄取率，保护微血管的结构和功能，对AD的治疗起积极作用。

2 神经胶质细胞和神经炎症反应

AD的神经炎性反应学说自1994年首次提出就一直备受关注，过度激活的神经胶质细胞产生炎症因子和神经毒素，参与Aβ的产生和沉积，导致Tau 蛋白过度磷酸化及氧化应激等。一系列研究结果显示：“通督启神”针法可阻抑AD模型小鼠海马区以及额叶的小胶质细胞(Microglial Cell，MG)、 星形胶质细胞(Astrocytes，AS)活化，阻断其介导的免疫炎性反应，以防止神经元变性坏死。具体如下。

2.1 抑制神经胶质细胞活化

AD患者脑内神经元凋亡，其程度与小胶质细胞活化数量成正相关[22]。小胶质细胞活化所介导的神经炎性反应可直接导致神经元突触损失，造成神经元凋亡，并加重Tau病理改变[23-24]。起初，小胶质细胞可吞噬Aβ，维持脑组织的稳态，保持细胞外清洁；当Aβ持续积累，超过小胶质细胞的吞噬能力，小胶质细胞依赖髓系细胞触发受体2(TREM2)和载脂蛋白E(APOE)，变成“水坝样”状态，并包裹Aβ，从而保护神经元；随着病情进展，Tau蛋白在受损的神经元中积累、磷酸化，诱导小胶质细胞进入非建设性的炎症状态，它们破坏突触，分泌神经毒性细胞因子，助长Tau的病理性扩散[25-26]。运用分子生物学研究方法，发现“通督启神”脉冲电针法可有效抑制小胶质细胞活化，减少其炎症反应过程中释放的主要促炎因子TNF-α，改善 APP/PS1小鼠学习记忆能力，且音乐电针在改善额叶皮层炎性反应方面优于脉冲电针，对AD有更好的治疗效果[27]。为进一步探究，采用免疫组化及WB技术，发现“通督启神”脉冲电针法可以上调海马区TREM2与其相关蛋白DAP12(DNAX-activating protein 12，DAP12)的表达[28]。TREM2分布于小胶质细胞膜表面，其激活一方面能有效抑制小胶质细胞活化，另一方面能激活小胶质细胞内表达的跨膜信号接头蛋白DAP12，进一步降低MG炎性因子释放，减少神经元的损伤与凋亡。此外，“通督启神”脉冲针法还可抑制SAMP8小鼠海马区星形胶质细胞的活化，且音乐电针有明显优于脉冲电针的趋势[29]。

2.2 减轻神经炎症反应

AD病理学研究发现，MG和AS在Aβ斑附近释放大量的促炎因子、抗炎因子、趋化因子以及其他相关因子，导致神经炎症，促进AD的发生、发展[30]。运用分子生物学研究方法，发现“通督启神”脉冲针法可以有效降低海马区的炎症相关因子COX-2、TGF-β1、TNF-α、IL-1、NLRP3、ASC、Caspase-1及HMGB1，从而抑制小胶质细胞活化，减少Aβ的沉积，减轻海马的神经损伤，改善脑内炎性状态[31-34]。

这些炎性因子在AD的不同阶段作用不同，在脑脊液外周血清中的含量也不同，导致研究难度大，国际上研究结果不统一。因此，为进一步研究胶质细胞、炎性因子和AD之间的相互作用，探寻“通督启神”针法调节神经胶质细胞活化和其产生的炎性因子，还需要进一步研究来阐明其作用机制。

3 Aβ生成与清除

Aβ假说在AD当前研究中最为广泛流行与接受。Aβ神经毒性作用是AD脑部病理改变的中心环节，其形成的淀粉样沉淀可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，释放炎症因子，促发炎症反应，诱导 Tau 蛋白异常磷酸化以及神经纤维缠结，损伤神经突触结构和神经元，导致神经元凋亡等一系列病理反应。一系列实验结果显示：“通督启神”针法可降低SAMP8和APP/PS1小鼠海马区、大脑皮层及血清中的Aβ1-40和Aβ1-42水平[11,35-38]，而患有阿尔茨海默病的转基因小鼠表现出与额叶萎缩相关的早期认知能力下降，这种变化甚至比海马体中的发生得更早[39],而“通督启神”针法在减少额叶淀粉样蛋白含量方面，音乐电针疗法比脉冲电针更有效[40]。此外，研究发现电针对更具有神经毒性的Aβ1-42改善更加明显[41]。进一步研究还发现，音乐电针在降低Aβ蛋白方面优于脉冲电针[42]。具体机制如下。

3.1 APP代谢及Aβ的产生

AD三大神经病理学特征，即大脑的海马和皮质出现细胞外淀粉样斑块、细胞内神经原纤维缠结(NFT)和大量神经元缺失。淀粉样斑块也称老年斑，主要由Aβ构成。APP可被α、β和γ分泌酶裂解。正常生理情况下，淀粉样前体蛋白(APP)经α分泌酶产生可溶性无毒的sAPPα和C38(CTF-α)，正常情况下，该代谢途径占优势；病理状态下，APP 经过β分泌酶的剪切生成 sAPPβ和C99(CTF-β)，C99再经膜内γ分泌酶剪切生成AICD(CTF-γ)和具有神经毒性的 Aβ1-40、Aβ1-42片段并被释放到胞外[43]，聚集形成淀粉样斑块，导致Tau蛋白过度磷酸化，形成神经元纤维缠结，从而导致突触功能障碍[44]，最终造成AD产生。因此，抑制β和γ分泌酶或者激活α分泌酶，均能减少AD患者脑部的Aβ浓度，是一直以来研究AD的关键治疗靶点[45]。“通督启神”针法正是围绕这几点而形成系统性研究，具体如下。

3.2 减少Aβ生成

3.2.1 上调α分泌酶表达 α分泌酶在APP水解途径中，其生成物没有毒性。研究表明，α通路和β通路可能会竞争底物APP，APP在正常大脑中优先被α分泌酶切割，而在AD中平衡则转向β通路。因此提高α分泌酶的活性或表达，可以减少APP经β和γ分泌酶水解途径产生Aβ沉积，使得APP的代谢向α分泌酶方向倾斜，是目前治疗AD的方案之一，如司来吉兰、他汀类药物，均可增加α酶的活性改善AD[46]。ADAM10是ADAM家族中最早被确认具有α分泌酶功能的蛋白酶，研究结果显示：“通督启神”脉冲电针法可上调ADAM10和ADMA17在SAMP8小鼠大脑皮层的表达，从而发挥治疗AD的作用[47]。

3.2.2 抑制β分泌酶 BACE1是人体最主要的β分泌酶，在神经系统内高表达，是大脑产生Aβ的关键酶和限速酶。AD患者BACE1表达上调，通过抑制BACE1表达可减少Aβ沉积，缓解认知障碍。但是由于其口服生物利用度、较长的半衰期及血脑屏障穿透而难以达到理想治疗目的。通过RT-PCR和免疫组化技术，研究发现，“通督启神”脉冲电针法可以通过抑制SAMP8小鼠大脑皮层BACE1的表达，降低Aβ水平[35]。

3.2.3 抑制γ分泌酶 γ分泌酶属于膜内切割蛋白，其空间结构非常复杂，由4个亚基按照1∶1∶1∶1复合组成，分别为早老素PS(presenilin)、单次跨膜蛋白NCT(nicastrin)、膜整蛋白APH1(anterior pharynx defective-1)和发夹结构蛋白PEN2(presenilin enhancer-2)[48]。这4个亚基关系密切，共同调节γ分泌酶活性，如APH1保持PS的空间结构稳定，PEN2促进NCT成熟并参加PS二聚体的水解，NCT保持γ分泌酶复合体结构稳定[49]。而PS1作为γ分泌酶催化亚基，是γ分泌酶的活动中心[50]。大量研究表明，PS1基因突变会导致γ分泌酶的活性增强[51]，导致对APP剪切过程中Aβ含量的增加。另一方面，NCT作为γ分泌酶的底物受体，其表达水平可影响底物APP的进入量，可影响其水解产物Aβ1-40和Aβ1-42[52]。团队通过免疫组化及WB技术发现，“通督启神”脉冲电针法可以通过抑制SAMP8小鼠海马区PS1和NCT的表达，抑制γ分泌酶的催化，减弱其对APP的剪切，降低海马区Aβ水平，改善认知功能[53]。

3.3 促进Aβ清除

大脑中的Aβ清除包括主要有3种途径[54]：①酶降解，即被相关Aβ酶在脑内降解，如脑啡肽酶(NEP)、胰岛素降解酶(IDE)、内皮素转换酶(ECE)及纤维蛋白溶酶；②细胞吞噬，如小胶质细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞等；③转运出脑，即透过血脑屏障进入循环系统被肝肾代谢或经脑脊液吸收进入淋巴系统清除。

低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)位于血脑屏障基底侧，是介导Aβ外向转运的最主要的转运体之一，研究已从细胞水平证实脑微血管内皮细胞摄取Aβ主要依赖于LRP1[55]。团队研究结果显示：“通督启神”脉冲电针法可以提升APP/PS1小鼠大脑皮层微血管的LRP1水平，促进Aβ转运出脑，从而降低脑部Aβ的表达[56]。值得一提的是，研究报道指出Aβ需要与载脂蛋白E(Apoliprotein E，ApoE)形成复合物后才能与LRP1结合运输出脑[57]，故团队进一步研究发现，“通督启神”脉冲电针法可以提升皮层APOE的表达，促进Aβ与LRP1结合，加快Aβ的转运出脑[58]。除此之外，其研究还发现，“通督启神”脉冲电针法可以有效降低额叶高度糖基化终产物受体(RAGE)的表达水平，减少Aβ向脑内转运[59]。RAGE与LRP1功能相反，大量分布于AD患者的脑微血管细胞膜上，其主要介导Aβ由血入脑的跨BBB运输[60]。

而在Aβ酶降解方面，NEP、IDE和ECE均是主要的Aβ降解酶，控制Aβ的降解速率。研究结果显示：“通督启神”脉冲针法可以提升SARMP8小鼠大脑皮层Aβ降解酶NEP、IDE及ECE的表达，改善AD学习记忆障碍[61-62]。

综上所述，“通督启神”针法可上调AD小鼠α分泌酶的表达,抑制β、γ分泌酶活性、促进Aβ酶在脑内降解及增加Aβ转运相关蛋白的表达，最终减少脑内Aβ水平，缓解神经毒性作用。

4 抗衰老与抗氧化

AD病理过程中，Aβ、Tau蛋白和炎症因子均能引起氧化应激，导致自由基水平增高而损伤脑组织。清除脑组织自由氧、延缓衰老是目前防治AD的基本策略之一。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)二者含量的变化可以反应病理情况下自由基的释放与清除及其对组织细胞的损伤程度。团队研究结果显示：“通督启神”脉冲电针法能够升高SAMP8小鼠SOD活性，减少血清MDA含量，延缓神经元的凋亡，此外音乐电针更为显著[63]。

在抗衰老方面，Klotho基因与抗氧化、抗衰老密切相关，AD鼠模型与同龄对照鼠比较，Klotho在海马、前额皮层和小脑均出现明显下降[64]，Klotho表达降低会导致LRP-1降低和RAGE增加，从而增加Aβ在脑内沉积，此外Klotho蛋白可以通过氧化还原系统调节谷氨酸和Aβ，突触可塑性有长时程增强作用，可升高海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位GluN2B的突触数量[65]，保护原代海马神经元和海马神经细胞，增强学习和记忆能力。“通督启神”脉冲电针法可上调抗Klotho衰老基因及蛋白的表达，延缓脑衰老，改善学习记忆能力[66]。

5 小结

中医学理论的“督脉-脑-神”一体化系统联系紧密：《素问》记载：“督脉者……，上额交巅，入络脑”；《类证治裁》曰：“脑为元神之府，精髓之海，实记性所凭也”。其中“通督启神”针法的主要穴位为百会、印堂和人中，《针灸大成》记载：“百会主心烦闷， 惊悸健忘，忘前失后，心神恍惚”“人中主失笑无时，癫痫语不识尊卑，乍哭乍喜”。印堂位于两眉正中，功能宁心安神。三穴合用，达通督启神之功，在治疗AD上具有多靶点、 多层次和综合良性的独特优势，脑循环方面，其可提升AD小鼠海马及前额皮层脑血流量，保护微血管的结构和功能，改善其葡萄糖摄取率。免疫系统方面，其能抑制AD小鼠海马区以及额叶的小胶质细胞、星形胶质细胞活化，减轻其介导的免疫炎性反应，防止神经元变性坏死。此外，其能上调抗Klotho衰老基因及蛋白的表达，延缓脑衰老；提升SOD活性，减少血清MDA含量而抗氧化。在病理方面，其可上调AD小鼠α分泌酶表达,并抑制β、γ分泌酶活性、促进Aβ酶在脑内降解及增加Aβ转运相关蛋白的表达。这些作用综合表现为减少脑内Aβ水平、缓解神经毒性作用和改善认知功能， 最终达到治疗AD的目的。

在未来的基础研究中，可结合胆碱能神经损伤、胰岛素信号转导异常、线粒体功能及结构损伤等方面探寻“通督启神”针法治疗AD的作用机理。此外，还可进一步研究“通督启神”针法的手针、脉冲电针和音乐电针各方面的实验效应及其间的相互差异以适合AD的类型及阶段。除了验证性研究，更应该注重“通督启神”针法作用的效应性和应用性研究，扩大“通督启神”针法的疾病种类及治疗范围。