针刺通过影响TLR4-NF-κB信号通路在治疗慢性神经退行性疾病中的作用*

孙远征，赵广然，刘彦麟，于天洋

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

慢性神经退行性疾病是由于中枢神经组织慢性退行性变性所产生的系列疾病总称。其以神经元或其髓鞘进行性减少为主要病理特征，疾病后期神经元等细胞出现不可逆的变性死亡。临床主要表现为认知功能和运动功能等不同程度下降,病情随着时间加重，影响患者生活质量[1]。Toll 样受体(Toll like receptor，TLR)是先天性免疫反应识别病原体的一个重要分子，在免疫系统中发挥着重要作用。已有研究证实慢性神经退行性疾病的发生发展与神经炎症关系密切[2-3]，其中TLR4- NF-κB炎症信号通路参与了慢性神经退行性疾病的发病过程[4]。近年来针刺疗法对于慢性神经退行性疾病临床疗效可观，针刺抗炎作用机制也得到越来越多学者的研究，本研究就针刺调控TLR4-NF-κB通路与慢性神经退行性疾病的关系进行综述，为治疗慢性神经退行性疾病提供新思路。

1 TLR4-NF-κB信号通路

1.1 TLR4

TLR(Toll-like receptor)家族最早发现于果蝇体内，主要分布于免疫细胞尤其是巨噬细胞、树突状细胞等，均属I型跨膜蛋白，胞外区由亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeats，LRR)功能区构成，为配体特异性识别的部位，TLR家族的配体种类覆盖面十分广泛，胞内区由Toll /IL-1受体(Toll/IL-1 receptor，TIR)结构域构成，介导TLR与接头蛋白之间的相互作用。TLR4 因其胞外LRR功能区特异性识别病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattem，PAMP)而成为最主要的特异识别LPS受体。TLR4受体在中枢神经系统主要表达于小胶质细胞及星型胶质细胞，且在小胶质细胞中表达水平最高[5]。TLR4的N端主要位于细胞外，主要用来特异识别LPS等PAMPs，C端位于细胞内，包含1个TIR结构域，主要用来刺激接头蛋白从而激活下游信号通路[6]。跨膜区由富含半胱氨酸的结构域组成。TLR4能够识别并结合相应的病原相关分子模式从而引发机体的固有免疫反应，在神经炎症的级联反应中占据重要位置[7-8]。

1.2 NF-κB

NF-κB(Nuclear factor，transcription factor，核因子-κB)是一种具有多向性调节作用的核转录因子，是 NF-κB/Rel 蛋白家族成员之一，其中 p65 /p50 是存在最广泛且是目前研究最多的二聚体复合物[9]。NF-κB 在炎性反应中能够与多种炎性反应调控基因的启动子相结合，从而调控炎症反应。无外界刺激时，NF-κB通常以非活性的p65 /p50 /NF-κB抑制因子α(Inhibitor of NF-κB-α，IκB-α)三聚体复合物形式存在于细胞质中，呈不活化状态。在细胞因子等多种刺激因素作用下，IKK(I-κB激酶)激活，I-κB磷酸化、泛素化后被蛋白酶降解，进而导致 NF-κB 的核定位信号序列暴露，并易位到细胞核，增强炎性酶类靶基因(如细胞因子、黏附分子等)的表达，最终影响炎症、氧化应激及细胞的增殖转化凋亡等生物学功能[10-11]。

1.3 TLR4-NFkB信号通路

TLR4作为最早发现且研究最深的TLRs家族的1个受体，在外源性或内源性刺激下可被激活，激活后的TLR4主要通过两条通路参与胞内信号传导，即MyD88依赖途径和MyD88非依赖性途径[12]。

MyD88最初发现于髓样细胞的分化中，由296个氨基酸残基组成，具有3个特殊的结构域，即N端的死亡结构域(Death domain，DD)、C端的TIR结构域中的成员和中间的INT结构域。当TLRs识别PMAPs后，发生二聚化形成TLR4/MD2复合物，信号由胞外传递到胞内以募集下游的接头蛋白分子。胞内结构域TIR与MyD88的羧基端结合，使其氨基端死亡结构区域活化，形成TLR-MyD活性复合体。同时MyD88氨基端再与IL-1受体相关激酶 (IL-1receptor-asso-ciated kinase，IRAK)结合，IRAK由两个活性激酶(IRAK-1和IRAK-4)以及两个非催化亚基(IRAK-2和IRAK-3/M)组成。结合的IRAK4磷酸化IRAK1并使其从复合体中脱离，与TNF相关受体因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6) 相互作用，激活细胞膜的转化生长因子激酶1(TAK1)，进而激活NF-κB抑制物的激酶 (Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases，IKKs)复合体，诱导IκB(Inhibitor of nuclear factor kappa-B) 磷酸化，从而促进NF-κB核转移诱发炎症反应，启动许多如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎性因子、细胞表面分子和趋化因子的表达。同时TAK1也能激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路，进而激活子蛋白-1(Activator protein，AP-1), AP-1磷酸化后同样进入细胞核内调控炎性因子的表达[13-14]。

非MyD88依赖性途径也叫TRIF依赖性途径[15]，通过含Toll/白细胞介素-1受体的IFN-β诱导蛋白(TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β，TRIF)和TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)传递信息。TLRs通过与TRAM结合活化TRIF，进一步作用于TRAF6从而激活NF-κB核易位。而这两种信号传导途径，均通过激活NF-κB分泌下游一系列促炎因子。

2 针刺调节TLR4-NFkB信号通路

临床上针刺作为绿色疗法治疗神经系统疾病收效可观，特别是对于慢性神经退行性疾病效果更佳，目前大量研究证实针刺抗炎与胆碱能通路关系密切。其主要机理可能是针刺通过调节机体中枢及外周迷走神经功能，从而调节乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)与α7nAChR 的表达，激活生物体内胆碱能抗炎通路，最终起到缓解炎症反应引起损伤的作用。其中枢环节是迷走神经末梢释放的Ach能够与免疫细胞上特异性受体结合形成具有活性的生物体复合物，激活NF-κB或JAK2/STAT3等信号转导通路[16-18]，抑制生物体内促炎因子的表达。

针刺疗法治疗慢性炎症性疾病中的双向调节作用已在临床长期实践中被广泛验证[19]，针刺的双向良性调节作用同样也体现在炎症介质方面[20]，针刺不仅可以维持或增高抗炎细胞因子的水平，同时还能通过清除致病因素进而抑制致炎细胞因子的合成，使炎症反应逐渐减少，最终恢复身体机能的平衡与稳态。

IL-1、IL-6和TNF-α这些炎症介质可增加微血管壁通透性和趋化作用，激活炎症细胞，有研究表明针刺可以降低TNF-α、IL-1和IL-6水平[21]。IL-2、IL-4是细胞因子内源性抑制剂，能够明显抑制TNF-α和IL-1等促炎因子的合成和释放，而针刺治疗对IL-2、IL-4细胞因子内源性抑制剂有明显激活作用[22],亦充分体现出针刺的双向调节作用。正常状态下炎症介质处于平衡状态，隶属于机体完整防御系统的一部分，一旦平衡被打破，炎症反应会扩大甚至失去控制，因此治疗的重点是如何调整并维持其平衡。

3 针刺调节TLR4-NFkB信号通路与慢性神经退行性疾病

3.1 肌萎缩侧索硬化症

肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 是一种致命性神经退行性疾病，发病率约为0.002%[23]。由于运动神经元发生不可逆的程序性凋亡导致全身肌肉萎缩。患者最初表现为肌束震颤和吞咽困难，随着病程快速发展， 运动能力逐渐丧失，最终死于呼吸系统衰竭导致的窒息。其具体的发病机理尚不明确，近年研究表明[24]，ALS的发生与细胞凋亡、自噬、焦亡与炎症等多种因素密切相关，到目前为止，已经有30多个ALS致病基因被鉴定出来，为临床治疗提供一定的思路。中医学认为ALS属于“痿证”范畴，认为其病位主要与肝脾肾相关，主要病机多为气血津液不足、筋骨失养，因虚致病，因此治疗上也多从肝脾肾论治，采用中药及针灸治疗疗效显著[25-26]。

近年来研究发现，蜂毒对于ALS、PD等疾病具有神经保护作用，研究人员[27]将hSOD1G93A转基因小鼠蜂毒足三里穴位注射与腹腔注射、生理盐水注射相比较，发现足三里蜂毒足三里穴位注射的炎症因子如TLR4、TNF-α在肌肉中的表达相对其他较低，运动神经元功能相对其他较高，且能减少脊髓前角运动神经元的死亡。提示蜂毒足三里穴位注射治疗可以改善肌肉功能，减少运动神经元死亡，延缓ALS发病的进展。研究者认为穴位注射可能作为一种化学刺激剂，激活穴位，随后在ALS动物模型的中枢神经系统中参与内源性免疫调节，从而干预疾病的发展。

Jiang等[28]观察电针针刺足三里穴位对ALS疾病伴随的呼吸系统症状疗效时发现，电针治疗降低SOD1G93A小鼠肺炎蛋白表达水平，且未接受电针治疗的SOD1G93A小鼠与电针治疗小鼠相比，巨噬细胞标记物IBA-1，升高了1.69倍。经电针治疗后，支气管周围Ibα-1和TNF-α免疫反应性细胞数量减少血管，免疫印迹显示降低了肺中IL-6的蛋白水平，并增加AKT和ERK等细胞存活。研究显示电针可以通过抑制NF-κB水平从而降低IBA-1、TNF-α、IL-6等炎症因子，来减少ALS疾病伴随的呼吸系统症状，延缓疾病的发展,可以作为伴随呼吸系统症状的ALS一种潜在的治疗方法。

很多研究表明针灸对炎症反应过程具有抗炎作用，基于这个结论PARK等[29]进一步探讨针刺特定穴位是否可以在遗传性ALS模型的hSOD1G93A小鼠中产生抗炎反应并抑制运动神经元丢失。研究采用电针针刺足三里并发现，在有症状的hSOD1G93A动物模型小鼠的脊髓和脑干中，小胶质细胞活性和TNF-α表达下降。并且显著改善了运动活动，减少了神经元细胞的丢失。研究表明电针治疗与抗神经炎症反应之间存在潜在的功能联系。

综上所述,炎症过程参与ALS疾病的发生及发展，但对于ALS的发病机制及炎症反应在疾病发展上的重要程度仍需继续探讨[30]。针刺的抗炎作用已有较多研究，针刺对于本病的临床疗效也极为可观，现已有研究应用针刺调节TLR4-NFκB通路来预防ALS的发生，相信在充分研究ALS发生机制与TLR4-NFκB通路的联系后，有望采用针刺调节本通路的方式干预疾病。

3.2 帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又称震颤麻痹,是一种常见的进行性中枢神经系统退行性病变，主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射异常等症状，多发生于50岁以上的老年人，其发病机制尚未明确，人们已提出了多种关于PD发病机制的假说, 如线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白异常聚集、细胞内钙稳态失衡、神经炎症等，目前尚无根治PD的药物，不同的病因病机为临床提供不同的治疗方法。中医学多将PD归于“痉病”范畴，本病多由于肝肾亏虚、痰瘀阻滞、脾伤痰聚等导致阴不敛阳、阳无所制和肝阳上亢，本虚标实是其病机关键[31]。治疗上多以滋养肝肾为主，在此基础上根据兼夹动风、血瘀、络阻及郁结等实邪病理产物的不同而辨证施治[32]。

有研究者采用针刺阳陵泉和太冲，治疗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型[33]，分别观察1 d、3 d和7 d时的炎症指标，结果显示针刺后1 d和3 d抑制巨噬细胞抗原复合物-1(MAC-1)的增加，减少环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(INOS)在第1、3、7天的表达，表明针刺抑制炎症因子，同时在MPTP组中，第7天的纹状体多巴胺(DA)浓度为46%，而针刺组的DA浓度为78%，且针刺抑制酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应性(IR)的降低，并在MPTP注射后第1、3和7天对纹状体(ST)和黑质(SN)产生神经保护作用。在这些结果的基础上，提示针刺可作为一种神经保护干预，调节小胶质细胞活化和炎症事件，从而治疗PD。

涂乾等[34]等研究针刺通过调节黑质中NF-κB治疗PD的作用，将48只雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针(EA)组(每组各12只大鼠)。通过连续40 d皮下注射鱼藤酮(1 mg/kg)建立PD模型。假手术组大鼠经皮下注射生理盐水。电针组每次均以2 Hz、1 mA、20 min针刺持续“风府穴”“太冲穴”连续28 d。在第40、68天分别测量每组大鼠的行为变化并评分。结果显示，与正常和假手术组相比，模型组大鼠的行为评分升高，通过电针干预显著降低。模型组大鼠酪氨酸羟化酶(TH)表达降低，NF-κB表达升高，而电针组则相反。结果提示EA干预可以改善PD大鼠的行为改变，这可能与其减少黑质中TH阳性神经元的丢失，下调NF-κB蛋白表达的作用有关。

王述菊等[35]研究EA干预PD疾病的信号通路时，认为EA通过调节大鼠黑质中ERK1/2信号和TNF-α和IL-1β蛋白，从而改善PD症状，研究人员将32只雄性大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和EA组。EA组每天针刺风府太冲穴持续14 d，并用蛋白质印迹法检测SN组织中酪氨酸羟化酶(TH)、p-ERK 1/2、炎性细胞因子TNF-α和IL-1P蛋白的表达水平，野外试验评估大鼠的水平和垂直运动能力。结果显示，模型组的水平和垂直运动得分显著低于正常对照组，EA组显著高于模型组，TH蛋白的表达水平明显升高，p-ERK 1/2、TNF-α和IL-1β蛋白的表达水平显著下调。提示EA疗法改善PD大鼠的运动能力，与其下调p-ERK 1/2、TNF-α和IL-1β蛋白的表达水平以及上调TH的表达有关SN中的蛋白质相关。

对于PD疾病，目前临床上还缺乏能长期改善患者运动症状及认知功能障碍的治疗药物，针刺对于PD患者具有一定临床疗效，具体通过调节本通路影响疾病有一定的研究，但针刺的穴位以及是否通电仍没有定论。以该通路作为切入点，不仅有利于深入针刺对于PD的作用机制的研究，而且有助于揭示本病的发病机制。

3.3 阿尔兹海默病

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)作为最典型的慢性神经退行性疾病，早期主要表现为记忆力减退，随着病程的进展最终出现语言障碍、认知功能缺失和运动失调等症状[36]。本病的病理基础认为是神经元细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloidy，Aβ)沉积和Tau微管相关蛋白磷酸化引起神经纤维缠结，最终诱发神经细胞凋亡，但其发病机制尚不明确[37]。中医学认为AD属于“痴呆”范畴，一般认为是由于年老肝肾亏损、脑髓失充导致的气血不足、肾精亏耗和脑髓失养，或气郁、痰浊和瘀血等痹阻而成，治疗上以治疗肾精亏虚、髓海不足为基础，虚证以补肾健脾养髓为主，实证则以化痰祛瘀开窍为主[38]。

Cai等[39]在观察电针治疗5XFAD小鼠(AD模型小鼠)时发现，未经处理的5XFAD小鼠与非5XFAD小鼠相比，新物体的探索时间缩短了1.4倍，而运用电针太溪穴治疗的小鼠在NOR(Novel object recognition)试验中对新物体探索时间相比5XFAD小鼠增加了1.3倍，在进一步实验中发现同模型组小鼠相比，经过电针治疗的5XFAD小鼠前额叶皮层中的小胶质细胞标记物-CD11b、星形胶质细胞标记物-GFAP以及COX-2含量分别减少1.9倍、1.5倍和1.6倍，说明认知功能的改善很有可能是通过抗炎机制发挥作用的。为证明电针是否能影响Aβ淀粉样蛋白的沉积，研究者运用蛋白印迹和酶联免疫吸附测定法测定Aβ1-42产生相关蛋白APP、APOE和BACE含量，发现5XFAD小鼠前额叶皮层中APP、APOE和BACE的含量分别比非5XFAD小鼠含量增加4.3、5.4、1.5倍，而电针治疗后APP含量较未处理的5XFAD小鼠减少1.5倍，APOE和BACE蛋白含量也出现减少，这充分说明了电针治疗可以减轻Aβ淀粉样蛋白在前额叶皮层的沉积从而改善疾病进程。

Feng PP等[40]研究发现同术后认知功能障碍小鼠相比，电针治疗的术后认知功能障碍小鼠在第3、7天的水迷宫测试中均有改善，接下来研究者运用酶联免疫吸附测定法测定小鼠在术后第3、7天的IL-1β、IL-6、TNF-α以及HGMB1的含量发现模型组小鼠的含量较对照组显著增多，而电针治疗后的小鼠在术后第3、7天IL-1β、IL-6和TNF-α以及HGMB1的含量较模型组则显著减少，说明电针可以通过减少小鼠海马体中促炎因子的释放从而改善小鼠受损的认知功能。研究者同时还发现电针治疗后小鼠海马体中TLR2和TLR4含量同疾病进展呈负相关，因此可以说明电针治疗的小鼠可能是通过负调控海马体中TLR2/4通路从而降低促炎因子IL-1β、IL-6,TNF-α以及HGMB1的分泌水平。Vereker E等[41]阐述在术后认知功能障碍动物模型中，电针可以通过负调控小胶质细胞TLR2/4信号通路从而减轻炎症，进而改善认知功能损害。

综上所述,可以发现针刺不仅治疗阿尔兹海默症效果可观，而且针刺通过调控TLR4通路参与AD病程，但对于具体全面的调控干预机制目前还不清晰，相信在充分研究AD发生机制与TLR4的联系后，有望用调节本通路的方式干预疾病。

4 结语

综上所述,随着老龄化社会的到来，神经系统疾病已经成为导致人类死亡和致残的主要原因之一，炎症作为诸多疾病相关性较高的方面影响着疾病的转归，神经系统也不例外，持续的炎症反应会使疾病加重,产生神经炎症与神经元病变之间的恶性循环,致使更多的神经元死亡。TLR4-NF-κB信号通路在多种慢性神经退行性疾病发病中均有参与，进一步探索本信号通路与疾病的发生发展的关系，从而辅助临床用药是继续研究的方向。针刺作为现今流行的外治法，具有安全无副作用等优点。针刺作用的基础研究逐渐被更多学者关注，研究发现了针灸可以调节炎症的分子机制，更为可贵的是它可以通过双向调节炎症通路，干预疾病，这种特殊的效应是其他诱导和抑制炎症的药物无法比拟的。

虽然针刺通过影响TLR4-NF-κB信号通路在多种慢性神经退行性疾病中起到重要作用，但同时在许多方面还需进一步探讨：许多神经系统疾病的病因和确切的发病机制尚不明确，这影响了诊断和治疗；神经炎症是不是神经退行疾病的始发因素还有待确定和研究；针刺调节炎症的研究目前只是一个开端，在具体通路和环节方面还需要做更多具体深入的研究，从而为针刺抗抑郁提供相关理论依据。因而,研究针刺通过影响TLR4-NF-κB信号通路在治疗慢性神经退行性疾病中的作用对炎症的调控成为治疗神经退行性疾病的一个新思路,也为对针灸作用机制的探讨指出了一个新方向。