花椒麻素改善2 型糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的作用

陆敏涛，罗婧，任廷远

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是遗传因素与环境因素共同作用的一种以高血糖为特征的代谢性疾病，主要由胰岛素作用抵抗和胰岛素分泌缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1,2]。除少数妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病外，糖尿病主要分为两型：1-型糖尿病和2-型糖尿病，1-型是胰岛素分泌绝对不足引起的；2-型是胰岛素分泌相对不足或受体受阻引起的[3,4]。随着社会环境的发展，糖尿病的发病几率越来越高，在中国20 岁以上的成人糖尿病患病率已为9.7%，目前已达9240 万，还有1.48 亿糖尿病前期病人，其中90%～95%是2-型糖尿病[5-7]。由此可见，糖尿病的防治迫在眉睫，如何预防和治疗这类慢性疾病成为了目前的研究热点。

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim）是芸香科（Rutaceae）花椒属（ZanthxylumL.）植物的果实，作为传统调味料和中药，被誉为“八大调味品”之一[8]。我国是花椒第一大生产国，2018 年年产量约45 万t[9]。花椒的药用价值早已得到认可，现代医学研究认为花椒具有抗氧化、杀虫、麻醉、抗炎镇痛、降血脂、除皱、抗癌、祛风除湿等多种作用[10,11]。花椒麻素是由花椒提取的一系列酰胺类化合物，也称其为花椒酰胺[12,13]，是产生麻味风味的主要来源[14,15]，迄今为止，已从花椒果皮中分离并鉴定出超过25 种花椒麻素[16,17]。随着分离技术及检测技术的不断发展，花椒麻素的种类还在不断的增加。研究表明，花椒麻素在-20 ℃石油醚中可以结晶并析出，呈现白色晶体，易溶于热石油醚、微溶于水。花椒麻素在常温下极不稳定，短暂暴露在空气中即可发生氧化或聚合反应而形成深色的黏稠膏状物质[18]。You YM[19]等研究表明，花椒麻素具有降糖作用可能是通过上调肝脏中PEPCK、GK 和G6Pase 的表达量以及修复受损的胰腺β细胞从而上调胰腺中PDX-1、GK 和GLUT2 的mRNA 水平和蛋白表达量而引起的。Ren TY[20,21]等研究表明，花椒麻素对糖尿病大鼠的降糖机制是激活AMPK 信号通路，介导GLUT4 从细胞质快速转运到细胞膜，达到降糖效果，且发现花椒麻素能改善大鼠的蛋白质代谢紊乱。陈朝军[22]等研究表明，花椒素和辣椒素能使大鼠体重增加速率减慢，减轻大鼠的脂肪肝症状，对胆固醇代谢紊乱有一定的改善作用。游玉明[23]等人研究发现花椒麻素有改善糖尿病导致的肠道菌群紊乱的作用，灌胃花椒麻素后，盲肠内容物中某些益生菌数量显著增加，而某些条件致病菌数量显著降低。这些结果均暗示了花椒麻素极有可能在因糖脂代谢紊乱导致的高脂血症及糖尿病等预防和治疗方面具有显著的功效。

花椒麻素在改善糖尿病方面，以往的研究主要集中在花椒麻素改善1-型糖尿病、肥胖等模型糖脂代谢的效果及机制，而对2-型糖尿病机体糖脂代谢紊乱方面的研究较少。T2DM 是由多种因素导致的代谢性疾病[24]，随病情的发展患者会出现肝肾损伤、坏疽、视网膜脱落等一系列的并发症[25,26]。目前临床上治疗糖尿病的方法主要为口服化学药物（如双胍类）或者注射胰岛素的方法来控制血糖，长期使用药物会对身体的正常生理功能产生严重的不良影响[27]，中药治疗相比于化学药治疗有更好的治疗优势，可以减轻患者毒副反应，增强患者机体免疫功能[28]。由于STZ 能够选择性地破坏β细胞上转运蛋白的转录，激活免疫应答和巨噬细胞抗原的改变，进而导致β细胞结构的破坏及细胞的损伤[29,30]，因此，本研究探索花椒麻素对调节STZ和高脂高糖联合诱导的2-型糖尿病小鼠体内糖脂代谢紊乱的作用效果，旨在探索花椒麻素预防和治疗2-型糖尿病的效果及作用机制，为花椒麻素的开发与利用提供科技理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒麻素，实验室自制（＞98%），提取过程参考任文瑾[31]的方法并略作修改；昆明种雄性小鼠，SPF级，20 g，55 只，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001。链脲佐菌素（STZ），美国sigma 公司；盐酸二甲双胍，美国sigma 公司；总蛋白定量测试盒（BCA 法）、甘油三酯测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、高密度脂蛋白测定试剂盒、低密度脂蛋白测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒，由南京建成生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

分析天平YH-A5003，五星衡器有限公司；恒温鼓风干燥箱DHG-9070，上海齐欣科学仪器有限公司；恒温水浴锅HH-4，常州奥华仪器有限公司；超声波清洗器KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司；血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；可调高速匀浆器FSH-2，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；紫外分光光度计L5S，上海仪电分析仪器有限公司；连续波长多功能酶标仪SpectraMax190，美国Molecular Devices公司；高速冷冻离心机H1-16KR，湖南可成仪器设备有限公司；光学显微镜Eclipse Ci-L，日本Nikon 公司。

1.3 动物饲养与样品采集

实验经贵州大学动物实验伦理委员会批准（编号：EAE-GZU-2020-P003），符合动物实验伦理。将55只体质量为22～24 g 的4～6 周龄健康雄性昆明小鼠饲养在通风良好，室温23±2 ℃，相对湿度45%～65%，12 h/12 h 明暗交换的环境中，自由摄食和饮水。基础饲料适应性饲喂一周后，根据小鼠体质量随机分为空白组（n=10）和高脂高糖组（n=45），空白组喂普通饲料，高脂高糖组采用高脂高糖饲料喂养6 周后，小鼠经过12 h 禁食，不禁水，注射60 mg/(kg·bw) STZ造模，造模期间自由摄食、饮水。建模后第7 d，禁食12 h，然后尾尖采集血样，血糖仪测量空腹血糖值（FBG），当FBG 值高于11.10 mmol/L 时，则造模成功[32,33]，并筛除建模失败的小鼠。把建模成功的40只小鼠分为4 组（n=10），分为空白组、模型组、花椒麻素低剂量组0.4 mg/(kg·bw)、花椒麻素高剂量组0.8 mg/(kg·bw)以及阳性对照组。

将实验室所制花椒麻素按照1 mL/100 g 小鼠体重灌胃量，精密称取花椒麻素溶于食用大豆油中，分别配制成浓度为4 mg/mL和8 mg/mL的花椒麻味物质溶液。于每日上午9:00～11:00 分别给低剂量组、高剂量组灌胃4 mg/mL 和8 mg/mL 的花椒麻素，空白组和模型组分别灌胃等量的大豆油，阳性组灌胃生理盐水配制的盐酸二甲基双胍溶液100 mg/(kg·bw)。对照组给予基础饲料，其余各组给予高脂高糖饲料。小鼠高脂高糖饲料配方参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》配制。实验期间，小鼠自由饮水和摄食，每周称体质量并记录采食量与饮水量，实验周期为28 d。

各组小鼠连续灌胃28 d 后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，装于离心管中，在0.5 h 内迅速进行离心处理（4000 r，4 ℃，15 min），将上层血清放入-80 ℃冰箱中冷藏留待后期检测。小鼠脱颈处死后，在冰上迅速被解剖取出肝脏，用生理盐水冲洗去污血后将其分为六份并分别记录重量，装入小袋并用锡纸包裹，放入临时液氮箱中，随后转移至-80 ℃冰箱中留待后续指标检测[34]。

1.4 指标测定

1.4.1 血糖值的测定

在灌胃试剂后的第0、7、14、21 和28 d，禁食不禁水6 h，使用血糖仪剪尾采血测定空腹血糖值[35]。

1.4.2 口服糖耐量测定

连续灌胃28 d，禁食不禁水12 h，根据2.00 g/(kg·bw)灌胃葡萄糖溶液，通过剪尾取血测量0、0.5、1 和2 h 时的血糖水平[36]，观察各组小鼠血糖的变化情况。血糖曲线下面积（AUC）根据以下公式计算[37]：

式中：A、B、C 和D 是灌胃葡萄糖溶液后0、0.5、1 和2 h 的血糖值。

1.4.3 理化指标的测定

血清和肝脏中的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及丙二醛（MDA）的含量测定，具体步骤见试剂盒说明书进行。

1.5 肝脏组织切片分析

解剖摘取各组小鼠肝脏，经4%多聚甲醛固定，固定状态良好后，进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片制作切片，苏木精-伊红（Hematoxylineosinstaining，HE）染色，光学显微镜下观察肝脏组织结构并分析。

1.6 统计学方法

本研究全部的统计学分析均由SPSS 22.0 完成，计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间分析比较用单因素方差分析，并用LSD、Duncan 法进行组间两两比较，以p＜0.05 表示差异，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 花椒麻素对糖尿病小鼠体重、进食量及饮水量的影响

“三多一少”是糖尿病的典型症状，即多饮、多食、多尿和体重减轻[38]。与空白组相比，小鼠给予STZ 注射后，其食量和饮水量都明显增加，出现多饮、多食、多尿等典型的糖尿病症状，同时活动量减少，且体毛蓬松无光泽、精神萎靡。由表1 看出，在试验期间，空白组小鼠体重增加了19.65%，而模型组体重减少了6.30%，与空白组存在显著（p＜0.05）差异，说明建模的成功。两个剂量组有效的抑制了糖尿病小鼠的体重减少，其中高剂量组作用显著（p＜0.05）。由此可见，体重的增量和灌胃剂量呈现一定的剂量关系。由图1知，进食量与饮水量的糖尿病模型组与空白组比较，都存在显著性差异，验证了糖尿病的症状；在经过花椒麻素灌胃治疗28 d 后，高、低剂量组的进食量都比模型组降低且显著（p＜0.05）差异；高剂量组的饮水量与模型组差异显著（p＜0.05），低剂量的饮水量比模型组低但差异不显著（p＞0.05）。花椒麻素能改善糖尿病小鼠的症状，其中，高剂量组的作用接近于阳性对照组。这与陈小敏[39]等人研究发现刺梨汁可改善糖尿 病小鼠的“三多一少”现象，与本实验结果相一致。

表1 花椒麻素对各组小鼠体重、进食量及饮水量的影响Table 1 Effect of Zanthoxylum on body weight, food intake and water consumption of mice in each group (n=10)

图1 各组小鼠进食量与饮水量的变化Fig.1 Changes of food intake and water consumption of mice in each group (n=10)

2.2 花椒麻素对2-型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

空腹血糖是糖尿病的基础数据，表示糖尿病患者的即时血糖水平，反映了基础胰岛功能，是判断糖尿病的主要依据[40]，根据国际通用的糖尿病诊断标准，正常人空腹血糖在3.3～6.1 mmo1/L 之内，高于11.1 mmol/L 则被诊断为糖尿病[41]，王祖哲[42]等人研究发现刺参低聚肽可降低糖尿病小鼠的高血糖。由图2 可知，给药处理前（0 d），糖尿病小鼠空腹血糖值均大于11.1 mmol/L，且显著（p＜0.05）高于正常对照组，提示糖尿病模型造模成功，各组糖尿病小鼠间给药前空腹血糖值无显著差异。然而，随着花椒麻味物质灌胃时间的延长，各组小鼠空腹血糖值发生了变化；空白组一直保持在正常范围内，而模型组血糖越来越上升，证明病情越来越严重，经灌胃治疗28 d 后，高、低剂量组小鼠空腹血糖分别降低了6.23%和3.32%，呈现出一定的剂量效应。

图2 各组小鼠空腹血糖的变化Fig.2 Changes of fasting blood glucose in mice of each group(n=10)

2.3 花椒麻素对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响

糖耐量是指机体对葡萄糖的耐受能力[43]，在正常机体中，当葡萄糖含量突然增加时，机体会迅速反应，分泌出更多的胰岛素；从而使体内葡萄糖水平始终维持在正常范围内。因此，葡萄糖耐量实验可以很好地反映出机体对体内糖含量的调控能力和体内胰岛β细胞的功能状况[44,45]。由图3a 可以看出，正常空白对照组小鼠在灌胃葡萄糖后体内血糖水平很快就上升到最高水平，随后也迅速降低，2 h 后即可回到正常水平。而模型组小鼠在灌胃葡萄糖后体内血糖水平很快就上升到最高水平后居高不下。与模型组相比，阳性对照组小鼠在灌胃葡萄糖后血糖水平在0.5 h 时即达到最高水平，随后快速下降，虽然在2 h 后未能回到初始状态，但仍可体现出阳性对照组小鼠的病情已有明显好转。高、低剂量组在0.5 h 时也到达最高水平，随后快速下降，虽不能回到初始水平，但能证明花椒麻素可以改善小鼠的糖耐量，且高剂量比低剂量效果更好。分析图3b，模型组的糖耐量曲线下面积比空白组显著（p＜0.05）增高，高剂量、阳性对照组与模型组存在显著（p＜0.05）差异，低剂量组有降低趋势但未达到显著。

图3 各组小鼠糖耐量及曲线下面积的变化Fig.3 Changes of glucose tolerance and area under curve in mice of each group (n=10)

2.4 花椒麻素对糖尿病小鼠血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 的影响

T2DM 是一种由于体内胰岛素分泌不足或出现胰岛素抵抗而引发的慢性代谢性疾病。T2DM 患者普遍伴随着不同程度的脂代谢紊乱，高血脂又会引起胰岛素抵抗[46]。脂质代谢异常是糖尿病的常见的并发症之一。与正常对照组小鼠相比，糖尿病模型对照组小鼠血清中甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著上升，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著（p＜0.05）下降，说明糖尿病病变导致了小鼠血脂代谢的紊乱。当采用不同剂量的花椒麻素灌胃28 d 后，由图表2 可分析出，与模型组小鼠相比，高、低剂量组小鼠的血清TG 水平分别下降了13.64%、10.71%；高、低剂量组小鼠的血清TC 水平分别下降了21.98%、17.83%。HDL-C 水平显著（p＜0.05）上升；LDL-C 水平有降低趋势，但未达到显著（p＞0.05）水平，说明花椒麻素可以在一定程度上改善因2-型糖尿病引起的血清TG、TC 和HDL-C、LDL-C 代谢紊乱，且有剂量效应。

本研究结果显示，模型组的TG、TC、HDL-C、LDL-C 均与模型组存在显著差异，证明T2DM 小鼠存在脂代谢紊乱，花椒麻素干预后能够显著降低T2DM小鼠TC、TG 水平，升高HDL-C 水平；LDL-C 虽未达到显著水平，但存在降低的趋势，这与陈萍[47]等人研究结果相一致，进一步证明了花椒麻素对T2DM 小鼠糖脂代谢的回调作用。

表2 各组小鼠血清相关指标的变化Table 2 Changes of serum related indexes of mice in each group (n=10)

2.5 花椒麻素对糖尿病小鼠肝脏TG、TC 的影响

花椒麻素对2-型糖尿病小鼠肝脏TG、TC 的影响如图4 所示，模型组小鼠TG、TC 含量比空白组分别显著（p＜0.05）增加了79.56%、310.44%。与模型组相比，经过28 d 的灌胃后，高、低剂量组的肝脏TG值均比模型组降低了28.31%；高、低剂量组的肝脏TC 值分别比模型组降低了43.53%和28.94%。

2.6 花椒麻素对糖尿病小鼠血清和肝脏中MDA 的影响

氧化应激是糖尿病及其并发症发生、发展的因素之一[48]，氧化应激是指活性分子和活性氧簇等的过度生成和（或）清除减少，从而造成体内自由基的生成和抗氧化防御系统之间的严重失衡[49]。MDA 水平可反映机体内脂质过氧化程度，是氧自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物，从而反映出细胞损伤的程度[50]。MDA 含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数，测试MDA 的量可反映机体脂质过氧化的程度，间接的反应出细胞损伤的程度。由图5 可知，与空白组相比，模型组的血清、肝脏MDA含量分别升高了356.67%、251.24%。在经过28 d 的花椒麻素灌胃后，与模型组相比，高、低剂量的血清MDA 分别显著（p＜0.05）降低了39.43%和39.56%，高、低剂量组的肝脏MDA 值分别比模型组降低了52.12%和47.45%，与药物治疗的阳性对照组已无显著差异（p＞0.05）。本研究结果显示，经花椒麻素灌胃28 d 后，能够显著降低T2DM 小鼠体内的MDA水平，这与高雪婧[51]等人实验结果相一致，表明花椒麻素能够有效降低T2DM 小鼠的氧化应激水平，增强其抗氧化能力。

图4 各组小鼠肝脏相关指标的变化Fig.4 Changes of liver related indexes of mice in each group(n=10)

图5 各组小鼠MDA 含量的变化Fig.5 Changes of MDA content in mice of each group

2.7 肝脏病理学分析

如图6 所示，空白组小鼠肝细胞结构清晰，细胞核形态正常。模型组小鼠肝细胞排列松散，大量脂肪空泡变性，胞体肿胀，胞质疏松淡染。与模型组相比，二甲双胍组的肝细胞排列整齐，无明显脂肪空泡，形态得到改善；经过28 d 的花椒麻素治疗，高、低剂量组的肝细胞比模型组排列较整齐，有少量空泡变性，形态有所改善。

图6 肝脏病理学分析Fig.6 Liver patholog

3 结论

本实验采用高脂高糖饲料联合链脲佐菌素诱导的2-糖尿病小鼠为模型，研究花椒麻素对糖尿病小鼠的影响。结果显示花椒麻素能缓解糖尿病小鼠的“三多一少”症状，高、低剂量组的空腹血糖值分别比模型组降低了6.23%和3.32%，并提高了糖耐量，降低糖尿病小鼠体内的TG、TC、LDL-C 及MDA 含量，升高HDL-C 含量，使糖尿病小鼠的血脂和肝脂得到有效改善，且HE 染色结果显示花椒麻素能降低肝组织的病理损伤。表明了花椒麻素能够从糖代谢、脂代谢及氧化应激方面对2-型糖尿病具有治疗效果，并呈现出了一定的剂量关系。为日后更深入的研究和利用花椒麻素预防和治疗2-型糖尿病提供了一定的理论依据。但其具体的作用机制，仍待进一步研究。