荟萃分析核桃仁抗2 型糖尿病机制

赵声兰，张凤，张丽明，郭琰，陈朝银

（1.云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）（2.云南省林业与草原科学院，云南昆明 650201）（3.云南经济管理学院医学院，云南昆明 650106）

随着生活水平的提高，2 型糖尿病的发病率逐年升高，在2040 年预计达到6.42 亿人[1]。2 型糖尿病是一种由胰岛素相对缺乏或敏感性下降引起的糖脂代谢性紊乱疾病，会导致糖尿病肾病、眼病及残足等并发症[2]。目前临床上治疗2 型糖尿病大多使用化学药物，具有一定的副作用，相比西药，中药成分复杂多样，可通过多靶点、多途径、多层次、多环节来改善疾病，治疗糖尿病具有安全、温和、持久的优点[3]。如：人参皂苷CK 能通过增强大鼠肾组织的抗氧化能力，抑制肾组织中TGF-β1（转化生长因子β1）的表达，从而降低糖尿病大鼠的血糖，调节血脂[4]；肉桂多酚除了通过抗氧化机制发挥作用外，还可通过调节胰岛细胞AKT（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）信号通路而促进胰岛β细胞分泌胰岛素，降低血糖[5]。

核桃系胡桃科（Juglandaceae）的核桃属（JuglanLinn.）、山核桃属（Carya）、缘核桃属（Annamocarya）等乔木植物[6]，其果仁食用及药用价值非常高，有健胃、补血、润肺、养神、延年益寿等功效[7,8]，是我国传统的药食同源佳品。核桃仁含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、二芳基庚烷类、萜类、有机酸类等化合物[9]，具有抗氧化、延缓衰老、降低血液黏度、防止血栓形成等多种生物学功能[10,11]，可用于防预防糖尿病[12]。

荟萃分析以系统生物学为基础，阐述机体与药物相互作用的原理和规律，可用来预测中药单体或复方的各有效成分及其作用靶点和参与的相关通路，探索药物与疾病间的关联性，解释药物治疗疾病的作用机制，可称之为元分析、系统药理学或网络药理学[13,14]。本研究运用荟萃分析探寻核桃仁化学成分防治2 型糖尿病的潜在靶点及相关通路，探讨核桃仁对糖尿病的多成分-多靶点的干预作用机制，为核桃仁的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 核桃仁活性成分与潜在靶点的筛选

通过TCMSP[15]（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）获得中药核桃仁的化学成分，筛选具有靶点的活性成分，汇集各活性成分的潜在靶点并通过Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org./）对药物靶点的相关基因信息名称进行交集统一。

1.2 2 型糖尿病靶点搜集

在OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）（http://www.omim.org/）、Genecards（http://www.genecards.org/）和TTD（Therapeutic Target Database）（https://db.idrblab.org/ttd/）三个疾病数据库[16]以“Type 2 diabetes mellitus”为关键词进行搜索2 型糖尿病相关靶点，并将三个数据库的靶点进行归并得到2 型糖尿病的靶点[17]。

1.3 药物-活性成分-疾病-靶点网络和PPI 网络构建

将活性成分靶点与疾病靶点通过R3.6.2 软件取交集，将交集靶点信息整理成Excel 格式，导入Cystoscape 3.7.2 软件，构建核桃仁-活性成分-疾病-靶点网络图，并运用Meta-analysis 和Network Analyzer 插件分析网络拓扑参数：选取节点度（Degree）前三位的活性成分为主要活性成分[18]。目前STRING（search tool for recurring instances of neighbouring genes）是蛋白质相互作用覆盖种类最多的数据库[19]，将交集靶点导入 STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）在线分析平台进行蛋白质-蛋白质相互作用 PPI（protein protein interaction network），将获得的PPI 数据导出为TSV文件格式并导入到Cystoscape 3.7.2 软件绘制网络图，利用Metascape 和CytoNCA 插件对其进行拓扑学分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表了该点在网络图中越重要，取DC、EC、BC、CC 值大于其2 倍中位数进行关键靶点筛选[20]。

1.4 GO 功能富集和KEGG 信号通路分析

将获得的交集靶点在STRING 平台进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）的信号通路富集分析和基因本体（GO）的生物过程富集分析，以p＜0.05 进行靶基因筛选，分析核桃仁干预2 型糖尿病的主要信号通路及生物过程[21]。

2 结果与分析

2.1 核桃仁活性成分与靶点收集

表1 核桃仁的11 种潜在活性成分Table 1 11 potential active ingredients of walnut kernel

表2 核桃仁防治2 型糖尿病的28 个潜在预测靶点Table 2 Potential 28 predicted targets of walnut kernel for type 2 diabetes

在TCMSP 数据库搜索到核桃仁有作用靶点的化学成分有11 种（见表1），共作用于83 个潜在靶点。药物要通过由脂质双分子层构成的生物膜进入细胞内，通常需有一定的疏水性。只有具有适宜的AlogPo/w（脂水分布系数2-6）的药物才能在体内易于到达目标结合部位，进而发挥药效，过高或过低需通过乳化、修饰等适当方法加以调整。口服生物利用率（OB）低的成分（如表1 中的胡桃苷、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖）一般不宜口服给药，可注射给药。成药性DL（drug-like 主要由溶解性和稳定性等因素构成）较低的也可通过包埋、乳化等适当方法加以调整。

2.2 核桃仁活性成分干预2 型糖尿病的相关靶点

在疾病数据库以“Type 2 diabetes mellitus”为关键词搜索2 型糖尿病相关靶点，Genecards 中选择score≥10 的靶点共获得2968 个靶点，OMIM 数据库获得31 个靶点，TTD 获得81 个靶点，合并三个数据库的靶点共有3015 个靶点。将核桃仁活性成分靶点与2 型糖尿病靶点通过R 软件取交集，得出28 个核桃仁干预2 型糖尿病作用靶点（见表2）。主要有SOD1、MAOB（胺氧化酶B）、CAT（过氧化氢酶）、DUOX2（双氧化酶2）、G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、GSTA2（谷胱甘肽S-转移酶A2）等氧化还原酶类，MMP9（基质金属蛋白酶9）、PRSS1（胰蛋白酶1）、MMP2（胶原酶IV），PTGS2（前列腺素G/H 合酶2）、FASN（脂肪酸合酶）以及激酶类的PRKCA（蛋白激酶α）、PRKCB、PRKCG、PRKCE、PRKCZ、PRKD1，因子类的IL5（白介5）、ILRL1、IGF2（胰岛素样生长因子II）、F10（凝血因子X）、F2、VEGFA（血管内皮生长因子A），以及ESR1（雌激素受体1）、NCOA2（核受体共激活剂2）等。

2.3 核桃仁活性成分-干预2 型糖尿病靶点可视化网络

采用Cystoscape 3.7.2 软件构建核桃仁-活性成分-疾病-靶点网络图（图1），图中包含39 个节点（1 个中药，1 个疾病，9 个活性成分与28 个靶点），组成了74条核桃仁活性成分与2型糖尿病靶点之间相互作用关系，其中鞣花酸（ellagic acid）作用于GSTA2、MMP2、MMP9、PRKCB和AR等8 个靶点，五没食子酰葡萄糖（Pentagalloylglucose）作用于PRKCB、PRKCZ、FASN和F2等8 个靶点，胡桃醌（juglone）作用于G6PD1、DUOX2、IL-5和SOD等6 个靶点，euprostin A 作用于PRKCB、PRKCZ和PRKCA等靶点，9-环丙基壬酸甲酯（Methyl 9-cyclopropylnonanoate）分别作用于PTGS2、MAOB和NCOA2等靶点，2,2",3,3",4,4"-四甲氧基-6,6"-联苯二甲酸二甲酯（2,2",3,3",4,4"-Tetramethoxy-6,6"-biphenyldicarboxylic acid，dimethyl ester）作用于KCNMA1（钙激活钾通道亚基α1）和PTGS2等靶点，没食子单宁（Eugeniin）、胡桃苷（Juglanin）分别作用于2 个靶点，且PRKCA、PRKCB和PRKCE等靶点同时对应于euprostin A 和Methyl 9-cyclopropylnonanoate 等活性成分，F2和F10等靶点同时对应于Eugeniin、Methyl 9-cyclopropylnonanoate等成分，体现出中药多成分、多靶点的作用体系。

根据拓扑学分析，节点度为前三位的是五没食子酰葡萄糖(9)、鞣花酸(8)和胡桃醌(6)，有相关文献报道，五没食子酰基葡萄糖具有缓解胰岛素抵抗、减少胰岛淀粉样多肽、模拟胰岛素和刺激葡萄糖转运等作用，可作为治疗糖尿病的先导化合物的候选化合物之一[22]；鞣花酸可能通过改善糖尿病小鼠肝脏胰岛素信号通路和促进肝脏自噬流来改善糖尿病小鼠肝脏自噬障碍等机制来达到降糖保肝作用[23]，此外，鞣花酸可能通过下调TXNIP、IL-1β炎症信号和抑制凋亡来改善糖尿病小鼠胰腺[24]，说明鞣花酸是潜在的抗糖尿病的化合物[25]；胡桃醌可抑制人肝癌HepG2 细胞增殖，促进细胞周期阻滞和凋亡[26]。由此可见，鞣花酸、五没食子酰葡萄糖和胡桃醌可能是核桃仁干预2 型糖尿病的主要活性成分。

2.4 PPI 蛋白互作网络

不同的靶点和信号通路之间会存在一定程度的信号转导，药物的治疗作用除表现为成分靶点的直接结合外，更多见于直接调控靶点与间接调控其他靶点相结合的调控方式，研究蛋白之间的相互作用网络，有助于挖掘核心的调控基因。将药物靶点与疾病靶点的28 个交集靶点导入STRING 数据库进行PPI 蛋白互作网络，结果如图2，网络中包含28 个节点，77 个边数，平均节点数5.5，根据拓扑学分析，DC、EC、BC 和CC 的中位数分别是：1、0.0396、0、0.351，取DC、EC、BC、CC 大于其2 倍中位数进行关键节点筛选，得到PPI 网络图的关键节点[27]，该网络的关键节点(节点数≥5)包括PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、PRKCG、IL5、DUOX2、F2、CAT、G6PD、SOD、PTGS2、MMP2、MMP9、ESR1、VEGFA、AR、FASN、IGF2，这些关键靶点起到连接其它蛋白的重要作用，且可能是核桃仁干预2 型糖尿病的靶蛋白。

图1 核桃仁-活性成分-疾病-靶点网络Fig.1 Walnut kernel-active ingredient-disease-target network

图2 药物-疾病靶标相互作用图Fig.2 Drug-disease target interaction diagram

2.5 核桃仁干预2 型糖尿病的GO 功能富集

将交集靶点基因在STRING 数据库进行GO 生物过程富集，筛选到p＜0.05 的GO 生物过程432 条，GO分子功能过程49 条，GO 细胞成分过程6 条。GO 生物过程按p 值从小到大排前20 的结果（见图3a）依次为：对有机物的应答、对刺激应答的正向调控、对含氧化合物的应答、对胞内信号转导的调节、对有机物的细胞应答、对细胞通信的正向调节、信号的正向调节、对化学刺激的细胞应答、对信号转导的正向调节，以及对生物加工的正调控、对细胞加工的正调控、细胞增殖的正调控、转运方面的调节、DNA 结合转录因子活性的正调控、有机氮化合物代谢加工、蛋白磷酸化正调控、定位调控等。

GO 分子功能注释结果按照p 值从小到大排前20的结果（见图3b）依次为：蛋白激酶C 活性、催化活性、钙依赖性蛋白激酶C 活性，离子结合、丝氨酸型内肽酶活性、抗氧化活性、蛋白结合、醇基作为受体的磷酸转移酶活性、锌结合、组氨酸激酶活性、激酶活性、标识蛋白结合、作用于蛋白的催化活性、信号受体结合、过氧化物酶活性、NADP（辅酶II）结合、氧化还原酶活性等。GO细胞组分注释结果按照P值从小到大排前的结果（见图3c）包括：胞外间隙、质膜、细胞外区部分、细胞外基质和内膜系统。

图3 核桃仁干预2 型糖尿病的GO 注释Fig.3 GO function annotation of walnut kernel intervention 2 diabetes

以上结果表明，糖尿病发病涉及多个体内生物过程的异常，同时说明核桃仁中的多个成分参与了多个体内生物过程来共同干预糖尿病的发生。核桃含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类等化合物，具有抗氧化、延缓衰老、降低血液黏度、防止血栓形成等多种生物学功能[11,28]，这与本研究的GO 功能分析结果显示细胞对含氧化合物的反应、过氧化氢代谢过程及生物合成等过程有关。

2.6 核桃仁干预2 型糖尿病的KEGG 信号通路分析

将交集靶点导入STRING 数据库中筛选出p＜0.05的信号通路86 条及其相关靶标，按p值从小到大排列的主要信号通路注释及其相关靶标见图4。直接参与糖尿病相关的通路有9 条：AGE-RAGE（糖尿病并发症中的糖基化终末产物受体）信号通路、MAPK（腺苷酸激活蛋白激酶）信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素分泌、PI3K-Akt（肌醇磷脂激酶-蛋白激酶）信号通路、胰腺分泌、2 型糖尿病、胰岛素信号通路、碳代谢，参与循环系统相关信号通路4 条：VEGF（血管内皮生长因子）信号通路、HIF-1（hypoxia inducible factor-1，缺氧诱导因子-1）信号通路、cGMP-PKG（环磷鸟苷-蛋白激酶G）信号通路、血管平滑肌收缩；内分泌相关的通路2 条：促性腺激素（GnRH）信号通路、雌激素（Estrogen）信号通路；炎症相关通路2 条：IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性；信号传导相关的通路4 条：VEGF 信号通路、松弛素信号通路、单体GTP 结合蛋白Ras 信号通路、HIF-1 信号通路；癌相关通路3 条：膀胱癌、肝细胞癌、癌相关MicroRNA；甲状腺相关通路2 条：甲状腺激素合成、甲状腺激素信号通路；神经递质通路3 条：胆碱能突触、谷氨酸能突触、血清素神经突触及与血清素代谢有关的色氨酸代谢；另有与氧化应激相关的谷胱甘肽代谢等信号通路。

由图4 可知，RKCE、PRKCZ等靶点参与2 型糖尿病信号通路，IGF2、PRKCA、PRKCB、PRKCG和VEGFA等靶点参与MAPK 信号通路，MMP2、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ和VEGFA等靶点参与糖尿病并发症的AGE-RAGE 信号通路，IGF2、PRKCA和VEGFA等靶点参与PI3K-Akt 信号通路，PRKCB、PRKCE和PRKCZ等靶点参与胰岛素抵抗通路，IL5、MMP9和PTGS2等靶点参与IL-17 信号通路，MMP9和PTGS2参与肿瘤坏死因子信号通路。由此可见核桃仁可能是通过调控PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IGF2、IL5、MMP9和PTGS2等靶点参与2 型糖尿病信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等信号通路达到干预2 型糖尿病的作用。

PPI 网络图发现PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IL5、F2、CAT、G6PD等靶点是蛋白互作的关键蛋白，起到连接其它蛋白的重要作用，通过KEGG 富集分析结果发现这些关键靶蛋白参与糖尿病、癌症、循环系统、炎症等四大类17 条相关通路及其他内分泌、信号传导、甲状腺和神经递质相关通路中。本研究发现与糖尿病相关通路主要是糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、MAPK 信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素分泌、PI3K-Akt 信号通路、2 型糖尿病、胰岛素信号通路和谷胱甘肽代谢等相关通路。AMPK 是生物能量代谢调节的关键分子，可以调节脂肪酸氧化和线粒体功能，促进葡萄糖转运蛋白GLUT4转运到质膜，增加葡萄糖摄取，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心[29,30]。胰岛素是机体内唯一降血糖的激素，胰岛素信号通路是一条很重要的2 型糖尿病通路，对糖尿病的发展非常重要[31]。由此可见， 核桃仁活性成分可能通过PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IL5、F2、CAT、G6PD等多靶点参与MAPK 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗和PI3K-Akt 信号通路等多条信号通路调节脂质代谢，从而实现干预2 型糖尿病的作用。

图4 核桃仁干预2 型糖尿病的KEGG 主要信号通路注释及其相关靶点Fig.4 Annotated diagram of KEGG main related signal pathways and targets of walnut kernel in type 2 diabetes

3 结论

本研究应用荟萃分析方法筛选出没食子酸、没食子单宁、五没食子酰葡萄糖、木麻黄素及胡桃醌等11个核桃仁活性成分及其83 个潜在靶点，与糖尿病靶点交集的有28 个靶点，其中鞣花酸和五没食子酰葡萄糖分别作用于前列腺素G/H 合酶2 和蛋白激酶等8 个靶点，胡桃醌作用于葡萄糖6 磷酸脱氢酶1 等6 个靶点，蛋白激酶α、β、ε等靶点同时受euprostin A 和9-环丙基壬酸甲酯等活性成分所作用，凝血因子II 和X 等靶点同时受没食子单宁、9-环丙基壬酸甲酯等成分作用，体现了核桃仁多成分、多靶点协同干预2 型糖尿病的作用机制[2]。