新型疫苗佐剂的研究进展

张 荣，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，刘学荣

（中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046）

疫苗接种目前仍然是预防疫病的主要措施，为有效防控传染病和畜牧业的有机发展提供了有力保障。随着免疫学和基因工程技术的不断深入及快速发展，DNA疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的研究也迈上了新的台阶，但是这些疫苗普遍存在免疫原性差的问题，因此，需要合适的佐剂来增强其免疫应答，提高机体保护力，减少疫苗用量，降低生产成本。传统佐剂，如铝盐佐剂，只能诱导体液免疫应答，不能诱导细胞免疫和细胞毒性T细胞应答，质量难以控制。为了突破这种限制，对新型疫苗相对应的安全有效佐剂的研发迫在眉睫。新型佐剂种类比较多，无统一的归类方法。根据佐剂的作用机制、研究现状及优缺点，将其分为免疫调节分子类佐剂、抗原递送系统类佐剂及前两种类型佐剂的联合类佐剂三种。下面从这三个方面做综述，为新型佐剂研究提供文献参考。

1 免疫调节分子类佐剂

免疫调节分子是由细胞分泌的某些物质，该类分子作为佐剂是通过直接作用于免疫系统，刺激相关免疫细胞的增殖和分化，从而增强抗原特异性免疫应答。选择具有免疫调节作用的佐剂将给新型疫苗的发展提供很大的助力。

1.1 CD40抗体佐剂

CD40是免疫应答中重要的共刺激分子，能很好地促进B细胞活化增殖和信号转导，通过激活CD40信号通路来增强抗原的免疫应答。将抗CD40抗体与抗原结合，发现这种结合可增强与其共轭相连的抗原的免疫原性和记忆性抗体的应答反应[1]。有研究发现，CD40抗体可以为B细胞提供CD40信号，增强与其共轭相连的抗原的免疫原性，可作为潜在的佐剂[2]。Ninomiya等[3]发现CD40抗体可增强记忆性抗体应答反应，同时还能促进T细胞的增殖，增强T细胞应答反应并引起迟发型超敏反应等。此外，CD40抗体其抗原表达与抗体制备过程相对简单、毒性小，是一种新型、有潜在价值的免疫佐剂，但目前仅限于实验室阶段。

1.2 CpG-ODNs佐剂

CpG寡脱氧核苷酸（CpG Oligonucleotide，CpG-ODN）是指人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸序列，与天然CpG模式识别受体有相似的免疫反应，能显著促进机体的特异性及非特异性免疫应答，是一种高效的Thl型疫苗佐剂[4]。作为TLR9的激动剂，CpG-ODN可通过TLR9介导的信号级联反应，直接活化DC和B细胞或间接活化NK细胞和T细胞，将体内的免疫环境向Th1型免疫类型转化[5]。用结合了CpG-ODN的猪伪狂犬病弱毒疫苗免疫新生仔猪，与单独接种猪伪狂犬病弱毒疫苗的仔猪相比，血清IgG滴度与粘膜IgA水平均提高了10倍以上[6]。CpG-ODN具有较强的免疫刺激作用和促进Th1型免疫应答的特点，能增强多种抗原所诱导的免疫反应，因此成为目前被广泛关注和研究的一种新型佐剂，但CpG-ODN在体内不稳定且可诱发自身免疫性疾病。

1.3 细胞因子佐剂

细胞因子是被抗原刺激后机体细胞产生的小分子可溶性多肽蛋白类物质。细胞因子有多种免疫调节功能，跟其他佐剂相比具有更独特的优势，是目前应用最广的一类分子调节佐剂。例如白细胞介素（Interleukin，IL）、干扰素（Interferon，IFN）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及趋化因子（Chemotactic）等。

白细胞介素IL中佐剂效应明显的当属IL-2。Hu等[7]研究发现，IL-2能有效增强小鼠骨髓细胞的成熟。除IL-2之外，IL-12、IL-21、IL-22也具有一定的佐剂效应来增强细胞免疫反应[8～10]。干扰素中的IFN-γ可增加抗原递呈细胞中MHC分子的表达，诱导Th1类应答，增强B细胞和NK细胞活性。用含有IFN-γ佐剂的弓形虫可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen，STAg）免疫小鼠发现IFN-γ可诱导产生高水平、长时间的sIgA和IgG抗体免疫应答[11]。将含卵清蛋白OVA的壳聚糖水凝胶和GM-CSF联合皮下注射小鼠，发现与对照组相比含GM-CSF的组OVA特异性抗体水平更高，增强了机体的体液和细胞免疫应答[12]。将趋化因子作为疫苗佐剂发现可以增强Th1和Th2型细胞的应答，如CCL20、CCL27以及CCL28等。有研究者将CCL27或CCL28作为DNA疫苗的佐剂，肌注小鼠发现外周IFN-γ和抗原特异性IgG都会升高，从而刺激肠相关淋巴组织和肺脏特异性T细胞分泌细胞因子，产生中和抗体[13]。

尽管大多数细胞因子活性易受内环境、水解酶等因素影响且体内半衰期较短，但通过对细胞因子的深入研究，这些问题也在不断得到解决，作为疫苗佐剂细胞因子有很大的潜力。

1.4 皂苷佐剂

皂苷（Saponins）是螺旋甾烷类化合物或三萜的天然糖苷，可激活哺乳动物的免疫系统。天然植物中提取的皂甙与细胞膜上的胆固醇形成复合物，共同促进T、B淋巴细胞增殖，诱导产生特异性MHC-I抗原限制性CTL，刺激分泌多种细胞因子，因此可以作为佐剂使用。

QuilA及衍生物QS-21是具有佐剂活性并应用最广的皂苷类佐剂，可以用来修饰T细胞和抗原呈递细胞。QuilA既能使外源性抗原刺激机体Th1免疫应答，也能诱导CTL应答，目前已成为亚单位疫苗及癌症疫苗的理想佐剂[14]。Qu等将弓形虫重组蛋白ROP18与人参皂苷Re联合免疫小鼠，发现添加人参皂苷Re可使ROP18诱导产生更强的体液和细胞免疫反应。Brunner等[15]将QS-21包裹于脂质体中发现可以消除溶血作用并保留其佐剂效果。因此，新型皂苷佐剂的进一步研究对现代疫苗的开发起至关重要的作用。

1.5 细菌毒素

细菌毒素中的霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热毒素（LT）、卡介苗（BCG）及脂多糖（LPS）等都可有效促进抗原特异性免疫应答[16]。Lycke等发现，将CT与LT分别与抗原合用口服免疫，可刺激肠道上皮细胞，引发B细胞生成IgA、T细胞增殖，从而增强免疫反应[17]。Iljine等[18]发现，BCG可以促进GM-CSF分泌、TNF-α基因转录及蛋白释放，增强巨噬细胞无丝分裂早期的活动。单磷酰脂质A（MPL）是一种被化学和遗传修饰后低毒的细菌性脂多糖，属于TLR4激动剂，可刺激巨噬细胞产生TNF，MPL和TNF共同促使NK细胞产生IFN-γ，选择性激活Th1细胞。Lu Y等[19]将低免疫原性的结核分枝杆菌（Mtb）抗原ESAT-6与MPL/DDA结合免疫小鼠评价MPL佐剂效应，结果表明添加了MPL佐剂的实验组可诱导产生更强的Th1应答和高滴度IgG1 IgG2b抗体。Kim等[20]用单磷酰脂A和脂质体包裹口蹄疫病毒样颗粒免疫小鼠发现可以促进对口蹄疫病毒的细胞和体液免疫。MPL作为佐剂已被证明在过敏疫苗、癌症疫苗和致病菌等一系列疫苗中有效，一般都是跟其他佐剂复合作用。

2 抗原递送系统类佐剂

抗原递送系统类佐剂通过控制物质释放促进对抗原、免疫调节分子或两者联合的有效递送来增强抗原的免疫原性。通过改变抗原或免疫调节分子的物理性状，控制抗原在体内的释放时间及靶向性，提高弱免疫原的有效刺激，增强免疫应答。

2.1 脂质体（Liposome）

脂质体是由非免疫原性和可生物降解的单层磷脂或连续多层磷脂组成的、能包裹抗原的球体，含有抗原载体和佐剂双重身份。被脂质体包裹的抗原通过与巨噬细胞膜融合后将抗原递送入细胞质内，增强巨噬细胞吞噬作用和抗原提呈作用，经MHCⅠ类途径激活CD8+T细胞。将OVA分别与免疫增强剂PAM和CpG-ODN寡核苷酸包裹于脂质体中免疫小鼠，发现与未包裹脂质体的PAM组相比，包裹于脂质体的PAM刺激DC细胞成熟能力更强[21]。脂质体能靶向免疫细胞，促进抗体交叉表达，作为佐剂虽然具有多功能性和可塑性，但由于在注射部位可能会引起疼痛症状，且脂质体稳定性低、成本高，不宜用于规模化生产。

2.2 免疫刺激复合物（Immunostimulating complex，ISCOM）及基质

ISCOM是由抗原、磷脂、胆固醇、QuilA组成的、粒径约40 nm的、具有较高免疫活性的脂质小泡，产生免疫应答的效力较全面，能延长抗原的存留时间，长期增强特异性抗体应答。ISCOM可以使APC摄取疫苗中的抗原，产生滴度高、较持久的抗体以及较强的Th以及CTL免疫应答，从而激活机体体液和细胞免疫应答。将含前S表位重组乙肝表面抗原和ISCOM佐剂联合肌肉注射小鼠，与Al（OH）3对照组相比能产生更高的抗体效价，具有更强的免疫增强作用[22]。ISCOM基质（ISCOM-matrix）不含抗原，且无毒副作用可单独作为良好的候选佐剂。Xiong Q等[23]利用QuilA、磷脂和胆固醇制成ISCOM-matrix作为佐剂与猪支原体肺炎抗原结合胸腔注射，可导致机体产生较强的免疫应答。ISCOM的加入可以减少抗原使用量，因此可作为亚单位疫苗的有效佐剂使用。

2.3 病毒样颗粒（Viral-like particles，VLPs）

VLP是一种不含病毒核酸、由一种或多种病毒结构蛋白经自我装配形成的、粒径只有20～120 nm的颗粒状复合物，具有高度有序的三维结构。VLPs具有较高的安全性和细胞摄取效率，还具有良好的溶解度、生物相容性以及靶向给药和载药能力[24]。能够使疫苗抗原通过多聚化形成大小约100 nm的非可溶性颗粒，被巨噬细胞等APC摄取、处理和提呈，有效诱导体液与细胞免疫应答,作为佐剂具有很广阔的应用前景。目前，研究者们已构建出多种病毒的VLPs，如口蹄疫VLPs、乙型肝炎病毒表面VLPs等，LIU等[25]经过对组装的嵌合型VLPs进行免疫原性和保护效果的评价，发现嵌合型VLPs能引起明显的体液和细胞免疫。GUO等[26]利用原核表达系统制备了VLPs免疫豚鼠、猪和牛，发现FMDV特异性中和抗体、T淋巴细胞和IFNγ被有效地诱导免疫动物。虽然已有多种病毒的VLPs在实验室中成功制备，且具有良好的研发潜力，但要在商业化应用还需要进一步的研究。

2.4 纳米颗粒（Nanoparticles，NPs）

NPs是指由粒径在纳米级（低于100/1000 nm）的超微粒子，可有效提高细胞、体液及黏膜免疫，比表面积大。NPs作为递送类佐剂包括有机和无机纳米颗粒两种。林雅华[27]将磷酸钙纳米颗粒和水痘带状疱瘆病毒的糖蛋白E混合，肌肉注射Balb/c小鼠，结果表明添加了磷酸钙纳米颗粒的组能够刺激机体产生更高水平的抗体滴度。潘雪[28]将肠道病毒71型病毒样颗粒（EV71VLP）与乙二醇壳聚糖联合注射小鼠，发现乙二醇壳聚糖佐剂组与单独注射EV71VLP的实验组相比，在诱导产生抗体速度方面具有更好的表现，且抗体滴度显著升高。Mehrabi等[29]将IL-2的质粒DNA包裹于壳聚糖中与副伤寒病毒抗原结合免疫小鼠，结果表明壳聚糖包裹的组，机体的细胞免疫和体液免疫水平明显升高。柴家前等[30]用纳米蜂胶颗粒（NPP）免疫初生公鸡，结果表明与对照组相比，机体T淋巴细胞比率和活性均显著增加。综上，纳米颗粒有助于抗原在细胞内加工，与MHC分子特异性结合、运输并递呈给效应细胞，增强机体产生天然免疫应答，还能够通过多种途径到达APCs调节免疫应答，具有免疫佐剂活性，但目前仍存在安全性和局部产生不良反应等不足，而且不同纳米材料的免疫策略及其理化性质的不同也成为纳米佐剂研究的一大挑战[31]。

3 复合系统类佐剂

随着新型疫苗的快速发展，单独使用一种佐剂有时难以诱导理想的免疫反应，不能满足抗疫需要。复合系统类佐剂指将两种或两种以上的佐剂联合应用，佐剂同时具备免疫调节分子和抗原递送系统的特性与功能，使其在发挥各自优点的同时又互相促进，最大程度地发挥佐剂效应，进一步调节或增强免疫应答，提高免疫效果。陈振普等[32]将甘氨酸锌和铝佐剂复合与鸡血清蛋白抗原联合腹部皮下多点注射小鼠，与单独铝佐剂的对照组相比，复合佐剂可以诱导更高水平的抗体应答，增强鸡血清蛋白诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答反应。苏菲等[33]将人参皂苷Rg1和重组大肠杆菌不耐热肠毒素rLTB联合作为佐剂，以卵清白蛋白（OVA）为抗原滴鼻免疫小鼠，发现与OVA单独免疫组相比，Rg1-rLTB能够显著上调Th1、Th2和Th17型细胞因子的转录水平，提高血清和局部黏膜中的OVA特异性IgA和IgG抗体水平。因此，探究免疫佐剂的生物学特性及作用机制，有利于合理利用并开发新型疫苗佐剂。由此可见，多种佐剂复合发挥协同作用在新佐剂开发中具有相当大的潜力。

4 展望

现有佐剂除了明显的疫苗增效作用外也有不足之处，在未来新型免疫佐剂研制中，研究者应同时考虑能够增强抗原免疫效力、有效激活体液与细胞免疫应答、稳定性良好、安全性高、便于生产和使用等方面。随着疫苗佐剂的不断研究和探索，尤其对于那些免疫原性差、细胞环境易降解的新型疫苗来说，具有免疫增强和抗原递送双重作用的复合佐剂是将来研究的一大趋势。因此，全面了解各个佐剂的机制和功能及其对免疫系统的影响，对推动新型高效佐剂的研发及临床转化应用具有重要意义。