滩羊羊毛与毛囊发育相关生物学机制研究进展

马丽娜，于 洋，马 青

（宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002）

滩羊是宁夏回族自治区主养品种，是国家二级保护地方优良品种，是一种独特的裘皮用绵羊品种。对滩羊品种特性的研究大多关注利用传统遗传学方法理论及生命体形态发生学分析裘皮形成的主要影响因素，以及如何进一步进行对滩羊品种进行合理利用及品种保护等，而对滩羊卷曲毛发表型的研究鲜少。随着分子生物学不断发展，对滩羊毛发卷曲特性的研究逐渐从传统遗传学转变为单个基因对该性状的影响，通过分析某个基因或多个基因的多态性，研究该基因与其调控性状之间的关联性。

1 滩羊裘皮特征

滩羊裘皮，又名二毛皮，是指羔羊出生后约35 d屠宰所得的皮张。此时，毛股长约7 cm，毛股的弯曲数达到5个以上，波浪状，自然弯曲下垂[1]。滩羊裘皮具有洁白如玉、晶莹剔透的外观、良好的柔软性以及保暖性。

滩羊毛属于异质毛，被毛由有髓毛、无髓毛、两型毛组成，还有极少部分羊含有少量干死毛[2]。滩羊不同时期被毛的类型不同，初生期时滩羊被毛为两型毛，毛长约4.5 cm，毛短而弯曲。而到35 d后的二毛时期，绒毛长出皮肤，被毛的类型由绒毛和两型毛组成，此时毛长约7 cm，毛股的弯曲达到5～6个以上[3]。二毛裘皮根据不同比例的被毛类型形成不同类型的图案，根据图案的类型将滩羊裘皮分为软大花型、串子花型、绿豆丝花型。其中，绿豆丝花型绒毛含量最少（30%～40%），串子花型次之（50%左右），软大花型绒毛含量最多（60%以上）[4]。

2 羊皮肤结构

羊的皮肤对保护体内器官组织不受到外部环境破坏以及保持体内水分的平衡具有重要作用[5]。羊的皮肤内部组织结构从外到里由羊的表皮、真皮以及皮下结缔组织三部分组成。羊的表皮由生发层和表皮层两部分组成。真皮层主要由毛囊层和真皮下的网状层两个大部分组织构成。真皮下分布着具有疏松的结缔组织，毛囊层实际上就是疏松的结缔组织，是由毛囊以及皮脂腺、汗腺等毛囊附属结构组成[5]。毛囊是一个形状类似于口袋状的组织结构[6]，从外到内依次由外根鞘（outerrootsheath，ORS）、伴侣层（companionlayer）、内根鞘（innerrootsheath，IRS）与毛干（hairshaft）构成。其中，外皮、皮质、髓质组成了毛干结构。而赫胥黎层（huxleylayer）、亨勒层（henlenslayer）以及内根鞘外皮构成一个完整的内根鞘结构。内根鞘包围毛干，是决定毛干的生长与分化所必需的结构[7]。毛球内部里面包含着稠密的真皮纤维细胞，它们内陷深入形成一个口袋状的结构，称之为毛乳头（dermalpapilla，DP）。毛乳头是一个高度特殊的结构，是毛囊发育调控的中心结构，负责信号的发送与接收[8-9]。毛乳头是由存在于毛囊基底部的真皮源性细胞（即真皮毛乳头细胞）组成[10]，在有关毛发毛囊的形成以及毛囊发育的周期循环中具有关键的作用。依据毛囊的形态和结构可以将其分成初级毛囊、次级毛囊两类。一般羊的初级毛囊形成于胎儿时期60～85 d，初级毛囊数目较少，结构上初级毛囊直径较大，具有2个皮脂腺、汗腺以及立毛肌等完整的毛囊附属结构；而羊的次级毛囊形成于胎儿时期75～115 d，次级毛囊数目较多，而在结构上直径较小，不具有完整的毛囊属结构，有且仅有一个皮脂腺，并且次级毛囊多数围绕初级毛囊分布[11-12]。

毛囊毛纤维的发育与毛囊的生长息息相关，毛囊各部分角蛋白基因表达各不相同，有着复杂的生物学过程[13]。毛囊也是一个高度循环的结构，由毛球的生长与衰退控制，主要分为3个时期，毛发生长早期（anagen，生长期）、毛发生长中期（catagen，退行期）和毛发生长晚期（telogen，休止期）。在毛发生长的不同周期，毛发特异性角蛋白表达不同，影响毛纤维生长发育和纤维性状。毛囊是调控毛发生长的皮肤附属器官，对于毛发弯曲形状的形成具有重要作用[14]。毛囊是一种特定的微型器官，具有周期性生长的能力，是组织再生研究的有效模型。毛发的形状、类型和颜色等性状不仅在胚胎发生期间确定，而且在每个毛发生长周期中重复确定。滩羊二毛皮特性是在滩羊生长发育的特殊时期（出生到30 d）表现的性状，在滩羊胚胎期已被奠定，其形成可能与胚胎期毛囊与毛纤维发育相关基因的表达及其调控有关[15]。赵正伟等[16]研究发现，软大花羔羊毛纤维鳞片结构与山羊绒相似，保暖性优于串子花羔羊毛，抗粘连性较串子花羔羊差，二毛期滩羊的增重与毛股弯曲数呈负相关；串子花羔羊毛纤维强度优于软大花羔羊。杨佐青[6]应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学方法，对滩羊、内蒙古苏尼特羊、中卫山羊和新吉细毛羊的皮肤蛋白进行差异表达研究，发现K34和K83可能与滩羊羊毛粗细及弯曲度呈相关性。牛姝等[17]研究发现，KRT71基因在毛囊内根鞘特异表达，并且在绵羊不同部位毛发弯曲与基因表达量呈正相关，进一步证明KRT71基因的表达与毛发弯曲相关。李向龙等[18]研究发现，滩羊初生期侧部弯曲数与初生期侧部毛长、二毛期侧部弯曲数间均存在极显著正相关；二毛期侧部毛长与侧部弯曲数呈极显著正相关。两型毛、绒毛的毛纤维直径标准差（FDSD）与毛纤维直径变异系数（CVFD）间均呈极显著强正相关；两型毛绒毛的平均纤维直径（MFD）与FDSD均呈极显著正相关；绒毛MFD与绒毛CVFD呈极显著正相关；绒毛MFD和平均纤维曲率（MFC）间呈极显著负相关。白玲荣等[19]建立及优化了滩羊羊毛蛋白质双向电泳图谱体系，为后续滩羊羊毛的差异蛋白质组学研究建立条件。赵国顺等[20]建议融合蛋白质组、基因组、转录组、代谢组等的组学，将从整体的角度研究组织器官功能和代谢的状态。路立里等[21]发现，羊毛弯曲与毛囊中细胞的不对称分裂、毛纤维中正副皮质的双边排列、不同角蛋白的不对称组成及角质化过程等相关。杨佐青等[22]通过双向电泳技术获得较高分辨率的滩羊4个不同生长时期皮肤双向电泳图谱，共获取19个差异蛋白点，质谱成功鉴定出15个蛋白点，其中发现1号、3号和10号点的14-3-3蛋白σ亚型、9号点为膜联蛋白A2、16号点为角蛋白25、18号点为微管蛋白α链，可能与滩羊皮肤生长调控有关。杨佐青等[23]通过iTARQ技术对内蒙古苏尼特羊、中卫山羊和新吉细毛羊分别与滩羊皮肤蛋白比对获得的差异表达蛋白进行分析，推测出14-3-3蛋白σ亚型在滩羊进化过程中与其二毛裘皮形成具有一定的关联性，KRT25、KRT34和KRT85可能与滩羊毛股弯曲和特定花穗形状的形成有关，TCHH在滩羊毛股弯曲的形成中具有重要的调控作用，KAP6和KAP11.1基因可能参与滩羊羊毛纤维直径调控。李亚超等[24]采用iTRAQ技术及LC-MS/MS的研究方法，对初生期和二毛期串子花型滩羊的皮肤样品进行蛋白质鉴定和筛选，发现初生期与二毛期裘皮共检出2 599个蛋白，其中初生期65个差异蛋白高表达，二毛期有122个差异蛋白高表达；发现HSPA4L蛋白可能对滩羊串子花型裘皮二毛期毛发的弯曲程度有一定的作用；ApoA1可能在滩羊串子花型裘皮二毛期毛囊的发育以及羊毛的弯曲形成中起到重要作用；GF-1因子可能与滩羊串子花型裘皮二毛期毛囊及毛干的快速发育相关。陈永宏等[25]采用iTRAQ技术及LC-MS/MS蛋白质组学研究方法，对串子花型、软大花型、绿豆丝型及其他不规则形花穗裘皮蛋白质进行鉴定和筛选，4类花穗型裘皮共检测出2 886个蛋白，其中有135、142、113个差异蛋白分别存在于软大花型与串子花型、绿豆丝型与串子花型、其他不规则形与串子花型3个对比组中。对有表达差异的蛋白进行分析，发现膜联蛋白与血管内皮生长因子可能与软大花型毛股形成相关，KAP3和KAP6可能与滩羊串子花型毛股结构相关。和东迁等[26]研究发现，羊毛的性状受多种因素的影响，如基因的变异、编码蛋白结构的多样性或者蛋白翻译后修饰以及外部因素的影响等。

3 羊皮肤转录组学研究

随着RNA-seq技术在生命科学的不同领域的发展与应用，皮肤转录组层面已经广泛的使用RNA-seq技术进行科学研究。但是，国内外对于动物皮肤转录组学的研究内容涉及的相对较少。Yue等[27]使用IlluminaHiseq2000平台对细毛羊皮肤进行了转录组测序，共有22 164个功能基因被注释，并将其归类到25类218条信号通路中，其中与毛囊发育相关的信号通路有17条，为绵羊遗传和功能基因组的研究提供良好的平台。Nie等[28]利用以生产地毯毛的羊为研究对象，通过对胎儿皮肤进行高通量测序，发现全局性改变的lncRNA（上调36个，下调26个）、mRNAs（上调228个，下调225个）和80个表达差异的新转录本，通过功能富集后发现了WNT、EDAR、BMP等几个关键信号和一系列的lncRNA对初级毛囊的诱导具有重要意义。Gao等[29]以克什米尔山羊为研究对象，用胎儿60、120 d、初生期的克什米尔绒山羊的皮肤进行高通量转录组测序，在胎儿60 d与胎儿120 d转换组内筛选出1 024个差异基因，胎儿60 d与初生期转换内筛选出1 801个差异基因，胎儿120 d与初生期转换期内无显著差异表达的基因。进一步分析发现，Wnt、TGF-β和Notch家族的成员在毛囊的分化和成熟过程中具有重要作用。

Kang等[30]用RNA-seq技术对1月龄、48月龄滩羊皮肤共鉴定出51 215个转录本，对前100表达量高的转录本的通路分析表明，这些通路对毛发或绒毛的发育相关，筛选出600个差异表达基因，检测到差异表达基因分别与信号、信号肽、二硫键、糖蛋白和分泌项有关，进一步分析表明，金属硫蛋白亚型3在滩羊皮肤中上调，提示其可能与中国滩羊卷毛的构象有关。刘玉芳[31]利用抑制性消减杂交技术（SSH）在滩羊两个生长阶段中共鉴定出67个差异表达基因，最终获得20个（包括KRT71和KRT83）与毛发生长相关基因。对差异miRNA进行GO和KEGG分化其主要富集到MA信号通路与AMPK信号通路等与卷曲毛发生长相关的通路。KRT71基因启动子区甲基化修饰是影响该基因在滩羊两个时期的差异表达的重要调控方式；Mir432和cap1抑制KRT83基因的表达，可能是调控滩羊被毛卷曲形成的重要原因[31]。何玉龙等[32]等通过高通量测序技术对成年滩羊和小尾寒羊皮肤毛囊中的miRNAs进行分析，在滩羊与小尾寒羊中共筛选到63个上调和16个下调的差异miRNAs。通过对差异表达miRNA进行富集分析，发现其靶基因主要参与细胞组分、代谢过程、细胞进程催化活性等；而KEGG通路分析表明，在内吞作用、糖酵解、糖异生和嘌呤代谢等信号通路上显著富集。上述结果表明，在两个品种的皮肤组织中筛选的差异miRNA可能通过调节其靶基因而参与调节羊皮毛囊发育的过程。

4 展望

由于目前科研工作者们在滩羊裘皮的研究中投入的科研经历尚不足，因此，有关滩羊裘皮性状遗传研究的相关报道还相对较少，需要进一步的完善。

目前，未找到国内外对于胚胎后期以及胎儿早期滩羊皮肤转录组学的研究，期望本文对于滩羊皮肤毛囊发育转录组学研究提供一定的参考价值。未来滩羊裘皮性状研究可从以下2点入手：（1）针对我国滩羊二毛皮的独特性，采用全基因组关联分析和胚胎期转录表达组分析等组学技术，揭示二毛皮卷曲度密切相关的关键基因与变异；（2）结合胚胎期皮肤毛囊动态发育过程，构建二毛皮发育的调控网络，解析二毛皮卷曲性状形成机制，进而较为全面的阐述二毛皮生长发育的遗传机制，为优质滩羊的二毛皮性状选育提供准确可靠的分子育种标记。未来，将会有更多影响羊毛弯曲、毛囊生长发育因子及调控机制被发现和阐明，可为动物种质资源的保护和利用提供参考。