梅花鹿体外胚胎生产关键技术研究进展

2021-03-27黄承俊

现代畜牧兽医 2021年9期

李宁，黄承俊

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳110032）

梅花鹿是一种经济价值较高的特种经济动物。由于梅花鹿季节性发情、繁殖周期较长、单产、自然繁殖率低，人们不得不借助新的繁殖技术。其中，需求最为广泛的是体外胚胎生产。该技术能有效利用淘汰资源[1]、活体卵巢[2]、未成熟个体等[3]快速扩大良种覆盖率，提高鹿群整体水平。

文章涉及的体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和体外培养（IVC）是体外胚胎生产的3个关键环节。通过对该环节的了解，不仅能掌握国内外梅花鹿体外胚胎的生产现状，对资源库的建设也有一定的帮助。

1 梅花鹿的生殖生理

梅花鹿是季节性发情动物，通常集中在9～11月份发情，周期为12～16 d。梅花鹿的生殖系统解剖结构与牛、羊等反刍动物相似，子宫呈典型绵羊角状，子宫角内妊娠[4]。梅花鹿发情前后，血浆中促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮黄体酮（P4）含量的变化模式也与牛、羊等反刍动物的相似，排卵发生在发情或LH峰后2 d内[5]。因此，梅花鹿的生殖调控或可借鉴牛、羊等反刍动物的相关经验技术。

2 卵母细胞的体外成熟

梅花鹿卵母细胞的体外成熟主要参照牛、羊等反刍动物的相关技术。成熟条件为5%CO2，饱和湿度的CO2培养法。温度多为38.5℃，也有38.8℃[6]。尚未见三气培养法的报道。基础液均为M199培养基。成熟时间为20～24 h，其中24 h的效果要优于20 h，但无统计学差异[7]，与牛、羊等反刍动物的结果相同。

成熟液的添加物主要有血清、卵泡液、FSH、LH、E2、表皮生长因子（EGF）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、半胱胺酸等，不同的添加物组合，效果差异很大。胎牛血清（FBS）和羊卵泡液（FF）的添加量多为10%、FSH为10μg/mL、LH为1μg/mL、E2为1μg/mL、EGF为50μg/L、HEPES为25 mmol/L、半胱胺酸为100μmol/L。卵母细胞的核成熟率在51%～80%[6,8]，EGF、胰岛素、转铁蛋白和硒可有助于核的成熟[9]。研究报道，FSH和E2是鹿卵母细胞体外成熟的必要激素[9-10]。但是，在繁殖季节，E2的效果并不明显，反而0.2 mmol/L半胱氨酸能够有效促进卵母细胞的体外成熟。基础液中添加10%FBS、10μg/mL FSH、1μg/mL LH、0.2 mmol/L半胱氨酸和50μg/L EGF，具有较好的成熟效果。非繁殖季节时，添加10%FBS、20μg/mL FSH、2 mg/L LH、0.4 mmol/L半胱胺酸和100μg/L EGF，成熟效果较好[7]。

繁殖季节卵母细胞的体外成熟率极显著高于非繁殖季节的体外成熟率。原因是梅花鹿为短日照动物，非繁殖季节的内分泌和黄体自然性循环受限，导致激素分泌不足，进而影响卵母细胞发育[7]。但是，完整且致密的高质量卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟，并不受季节的限制[6]。

另外，卵巢对保存时间和温度也有一定的要求。短时运输时，时间不得超过6 h，保存温度为30℃；长时运输时，时间为6～12 h，保存温度为20～25℃；当运输超过12 h时，保存温度应控制在10～15℃[8,11]，否则会极大降低卵母细胞的体外成熟率。

3 成熟卵母细胞的体外受精

研究发现，20%发情羊血清（SS）是各种鹿类体外获能的关键[9,12]。牛经典的肝素获能机理也符合鹿类[13]。鹿的体外受精程序可参照牛、羊的进行。因此，梅花鹿体外受精的研究分为血清和肝素两个方面。由于梅花鹿相关方面的研究相对较少，其中使用血清的报道居多，而肝素的多见于其他鹿类[14]。

受精条件有饱和湿度的CO2（5%）培养法和饱和湿度的三气培养法（5%O2、5%CO2、90%N2）。温度多为38.5℃，也有38.8℃[6]。据马鹿相关试验显示，温度在38～39℃之间，精子的体外获能效果差异并不显著，但以38.5℃最佳[14]。梅花鹿体外受精温度的选择或可参照马鹿的使用。基础受精液多为SOFaa液，也有用TALP液的[9]。受精时间均为18 h，尚未见BO液的报道。

精子体外获能的方法为Percoll梯度离心法，尚未有上浮法和孵育法的报道，可能与使用血清有关。在马鹿方面，以BO液为受精媒介进行相关试验，结果显示，Percoll梯度离心法的精子顶体反应率和活力均显著低于其他两种[14]，表明梅花鹿体外获能方面仍有很大的研究空间。

受精液的添加物基本均是20%的发情羊血清（SS）。精子用Percoll梯度离心法处理后，直接用受精液进行稀释备用。使用SOFaa液时，也有用SOFaa+10 mmol/L Hepes进行精子洗涤，再用SOFaa+20%SS+5 mg/L肝素进行稀释备用[6]。在血清和肝素的使用上，有学者曾对TALP液+20%SS、TALP液+2%SS、TALP液和TALP液+10 mg/L肝素的受精效果进行对比。结果显示，TALP液+10 mg/L肝素的受精率最低，与TALP液组一样，显著低于TALP液+2%SS，极显著低于TALP液+20%SS组[15]。上述研究表明，在梅花鹿的体外受精方面，也曾有研究人员对肝素进行探索，只是结果不理想，不如Berg等的研究结果[16]。

受精时，精子的使用浓度多为1×106/mL，也有3×106/mL[6]。据报道，1×106/mL浓度的精子受精率要显著高于0.5×106/mL浓度，多精入卵率可达22%[9]。马鹿也有多精入卵的现象，使用最佳浓度0.4×106/mL时，多精入卵率可达15%[12]。尚未见其他鹿类的相关研究。但多精入卵是否是鹿类的共性，对胚胎发育产生的影响，还需进一步探索。

4 受精卵的体外培养

培养条件主要为饱和湿度的三气培养法（5%O2、5%CO2、90%N2）[6]。温度多为38.5℃，也有38.8℃[6]。基础培养液均为SOFaa，培养时间为7～8 d，尚未见其他培养液的报道。培养方式有SOFaa+10%FCS[9]、SOFaaBSA+10%FCS+输卵管上皮细胞单层共培养[6,16-17]、DSOF+10%FBS[18]、改良SOF液[19]等。据报道，鹿类胚胎与其他反刍动物一样，也有发育阻滞现象，而输卵管上皮细胞单层，能有效促进胚胎的进一步发育[17,20]。当采用输卵管上皮细胞单层共培养时，能显著提高梅花鹿的桑囊胚率[6]，与上述试验结果一致；但该试验中，未采用共培养的组，桑囊胚率均为零，与那些未用共培养方法却仍获得桑囊胚的研究不相符[9,19]。卵母细胞成熟时的质量也决定胚胎未来的发育程度[21]。生产中，鹿体内胚已步入应用阶段[22]，体外胚的发展已迫在眉睫。体外胚胎生产各环节间的复杂联系，仍是研究的一大难题。