龟鹿二仙胶在骨质疏松症领域研究进展及其现代应用迷思

司誉豪 马勇 许奇 李绍烁 郭杨 潘娅岚 王礼宁 刘孟敏 孙杰 涂鹏程 吴承杰杨光露 王建伟 尹恒*

1.浙江省中医院骨伤科，浙江 杭州 310006 2.南京中医药大学骨伤研究所、骨伤修复与重建新技术实验室，江苏 南京 210023 3.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023 4.南京中医药大学无锡附院骨伤科，江苏 无锡 214071

龟鹿二仙胶又名龟鹿二仙膏、龟鹿参芪胶、龟鹿胶等，出自于王三才所著《医便》，由龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子组成，有滋阴养血、填精助阳等功效[1]。《医便》载其：“专治男妇真元虚损，久不孕育……服此胶百日，即有孕……并治男子酒色过度，销铄真阴；妇人七情伤损血气；诸虚百损，五劳七伤，并皆治之。”临床常用于阴阳两虚、虚劳、遗精阳痿、腰膝酸软、痿软无力、视物昏花等。中医对于骨质疏松症描述有“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”等，其中以“骨痿”症状最为贴切，《素问·痿论篇》曰“肾者水藏也……则骨枯而髓虚……发为骨痿。”张介宾也直言“肾痿者，骨痿也”。可见，肾虚髓亏为骨质疏松症的根本中医病机，这与龟鹿二仙胶适应症相合，因此临床常用于论治骨质疏松症。目前尚无医家对龟鹿二仙胶的现代临床应用与机制研究进行系统总结，故而笔者整理了相关文献进行综述，为深入研究龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的临床疗效与机制提供相关参考。

1 临床应用

当代医家中，周修通[2-3]于2001年最早公开报道将龟鹿二仙汤运用于骨质疏松症的治疗中，他自拟“龟鹿二仙汤”联合葡萄酸钙片/碳酸钙片用于治疗罹患骨质疏松症的老年女性，结果提示联合使用“龟鹿二仙汤”可明显增强西药疗效。而后杨伟岸[4]运用龟鹿二仙汤加味治疗老年脊椎骨质疏松性腰背部疼痛获得了92.1 %有效率，黄民兴等[5]也观察到龟鹿二仙胶可明显降低脊椎骨质疏松性腰背痛老年患者VAS评分。陈治谌[6]的研究将龟鹿二仙胶丸剂与福善美进行对比，发现二者在骨代谢指标及骨密度(bone mineral density，BMD)方面均具有良好的疗效，区别在于，福善美1年内即可显著提高患者BMD，而龟鹿二仙胶丸剂的疗效需3年方可较为明显。尹恒等[7]亦是将龟鹿二仙胶与西药单独对比，发现龟鹿二仙胶对于原发性骨质疏松症患者BMD的提升效果显著优于阿尔法骨化醇。王科艇等[8]的研究稍有不同，他们将龟鹿二仙胶与福美加联用钙尔奇作对比，发现两种疗法干预6月后在BMD方面无显著差异，而龟鹿二仙胶可额外加强患者日常体力、精力，在提升患者健康状况上略优于联用福美加与钙尔奇。

注射用鲑鱼降钙素可以显著降低高转换型骨丢失[9]，齐润文[10]发现龟鹿二仙胶联合鲑鱼降钙素可明显缓解骨质疏松性腰背痛，且长短期疗效均明显强于单用鲑鱼降钙素。此外，也有将龟鹿二仙胶与抗阻运动联合使用的报道，结果显示抗阻运动与龟鹿二仙胶均可改善患者高转换型骨代谢，提高腰椎、髋部BMD，而二者联用后对患者破骨细胞相关指标的抑制作用明显优于单用其一[11]。齐鹏坤等[12-13]针对绝经后骨质疏松症进行了两种试验方案，既采用龟鹿二仙胶对比阿仑膦酸钠，也比较了两药联用与单独阿仑膦酸钠/龟鹿二仙胶的疗效差异，结果显示二者联用比单用其一可显著提高患者BMD，缓解疼痛。并且，龟鹿二仙胶抗骨质疏松作用可能与调节患者体内雌二醇、睾酮有关。张健[14]的研究方案与齐鹏坤等[13]几乎相同，结果显示，龟鹿二仙胶联合阿仑膦酸钠对于绝经后骨质疏松症的临床疗效优于阿仑膦酸钠，可明显升高患者腰椎及股骨近端BMD，改善血清IGF-1及TNF-α水平。

2 基础研究

2.1 在体实验

对于龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的具体机制研究目前仍仅见于国内学者及文献，目前涉及到的动物模型包括：去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松模型[15-21]、激素诱导大鼠骨质疏松模型[22-23]、激素诱导斑马鱼骨质疏松模型[24-26]。其中，以卵巢切除12周后建立的OVX大鼠骨质疏松模型最为常见，张瑶等[17,19-20]以OVX大鼠为对象进行了三种实验方案，首先他们对比了龟鹿二仙胶与戊酸雌二醇片，结果显示，与戊酸雌二醇片比较，龟鹿二仙胶治疗组 Ca 含量、BMD显著增高，而P、Ca/P、β-Crosslaps、PINP 含量差异均无统计学意义。而后他们比较了包括龟鹿二仙胶在内的多个补肾方对于OVX大鼠骨质疏松模型生物力学以及骨代谢指标的影响，发现龟鹿二仙胶、补肾健脾方、仙灵骨葆胶囊组的大鼠BMD显著高于雌二醇组大鼠，而二仙汤组与仙灵骨葆胶囊组的β-Crosslaps显著降低。在二仙汤、龟鹿二仙胶、补肾健脾汤三者比较中，补肾健脾汤组β-Crosslaps及PINP含量均显著增高，龟鹿二仙胶组PINP含量显著增高，Ca/P比值高于仙灵骨葆胶囊组、二仙汤组、补肾健脾汤。在腰椎压缩试验及股骨三点弯曲试验中，龟鹿二仙胶组、二仙汤组、补肾健脾汤组的最大负荷量、最大应力、弹性模量明显高于雌二醇组与仙灵骨葆胶囊组，其中以龟鹿二仙胶组最为显著，表明其具有提升OVX大鼠生物力学性能，改善钙磷代谢，促进骨形成与抑制骨吸收的功效。上述三种方案[17,19-20]均使用了同一种干预剂量，而牛素生等[16,18]研究则将龟鹿二仙胶分为高、中、低剂量进行干预，通过测定OVX大鼠血清E2、血清ALP、TRACP、左侧股骨BMD、最大载荷、骨小梁面积等指标发现，中剂量(按体表面积换算人临床用量而来)龟鹿二仙胶对于调节OVX大鼠激素水平，增强骨密度与骨显微结构效果最佳。陈竑明等[21]的研究方案与张瑶等[17,19-20]类似，但着重检测了骨骼肌Akt蛋白表达量，发现龟鹿二仙胶对OVX大鼠有显著的治疗作用，能升高腰椎BMD及Akt蛋白和基因的表达量。王立新[15]将龟鹿二仙胶与倍力美对比，发现龟鹿二仙胶提取物对大鼠胫骨上段松质骨的静态学参数及动态学参数都有较好的改善作用，在股骨中段的皮质骨、远段松质骨、腰椎松质骨的生物力学改善效果与倍美力相近。

郭建博[22]与徐卫峰[23]均采用地塞米松诱导大鼠骨质疏松模型，前者检测血清指标与牛素生等[16]的研究相近，包括TRACP-5b、ALP、N-MID-OT、股骨BMD等，结果表明龟鹿二仙胶对于激素诱导的骨质疏松大鼠也具有提高骨密度、促成骨、抑破骨的作用，且效果明显优于阿仑膦酸钠。后者着重探讨机制，将龟鹿二仙胶分为高、低剂量组，发现两种剂量均能显著增加大鼠股骨BMD，降低血清ALP、IL-6、IL-β、TNF-α水平，提高降钙素与血清E2。Western blot显示大鼠滑膜Nrf-2、HO-1蛋白表达显著升高，而p-IκB、P-NF-κB蛋白表达明显下降，表明龟鹿二仙胶发挥抗骨质疏松作用可能与调控Nrf-2/HO-1/NF-κB有关联。

尹恒[25]与钱哲[26]的研究均采用了激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型。前者证实了龟鹿二仙胶能够促进激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型合成I型胶原蛋白，且此机制是通过上调TGF-β/Smad信号通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2及下游蛋白Smad3实现的。后者除再次验证龟鹿二仙胶抗骨质疏松作用与激活TGF-β/Smad信号通路有关外，还发现龟鹿二仙胶可降低IL-6、IL-β、TNF-α等炎症因子，调控核转录因子NF-κB和AP-1抑制炎症反应所致骨量丢失。

2.2 离体实验

目前龟鹿二仙胶的离体实验均为细胞水平研究，涉及成骨细胞(osteoblasts，OB)/成骨细胞系(Mc3t3-E1、ROS17/2.8)、破骨细胞(osteoclasts，OC)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，人子宫内膜基质细胞(human endometrial stromal cells，HESCs)。徐卫峰[23]采用地塞米松诱导小鼠成骨细胞系Mc3t3-E1损伤，观察龟鹿二仙胶含药血清对成骨细胞系的保护作用，发现含药血清组的细胞上 IL-6、IL-β、TNF-α水平显著下降。Western blot结果发现Nrf-2、HO-1蛋白表达明显升高，并且p-IκB、P-NF-κB蛋白表达明显下降。表明龟鹿二仙胶可显著改善地塞米松诱导的骨质疏松，且机制与调控Nrf-2/HO-1/NF-κB有关，该结果与其在体实验结果相吻合。而钱哲等[27]采用了大鼠成骨肉瘤细胞系ROS17/2.8，发现龟鹿二仙胶可通过调控TGF-β而促进 I 型胶原的表达起抗骨质疏松作用。该结果与尹恒[25]一致，后者发现龟鹿二仙胶含药血清可明显提高ROS17/2.8细胞株TGF-β1、TGF-β2、Smad3、COL1A1、COL1A2蛋白及基因表达量。袁明阳[28]同样采用了ROS17/2.8作为研究对象，其实验方案、结果与尹恒[25]、钱哲等[27]的研究基本一致，在此不做过多赘述。钱康[29-30]的两项研究均体外分离大鼠原代OB，分别探究了不同浓度龟鹿二仙胶含药血清(20 %、15 %、10 %)对OB增殖、周期以及OPG/ODF系统的影响，结果显示龟鹿二仙胶含药血清对OB具有促进增殖和抗凋亡作用，且浓度越高，效果越显著。同时当含药血清浓度在20 %时OPG基因表达量最高，而ODF基因表达量最低，亦是呈现出了浓度依赖性。该结果与朱崇梅[31]的结果如出一辙，后者亦是发现龟鹿二仙汤含药血清可呈剂量依赖性地促进OB增殖分化，并且上调OPG表达和抑制ODF表达。

毛翠平等[32]不但体外分离得到大鼠原代OB，还利用1,25(OH)2D3诱导骨髓单核细胞获得原代OC，发现10 %龟鹿二仙胶含药血清可增加 IGF-1分泌量，促进OB增殖，并且能够显著抑制由1,25(OH)2D3诱导的破骨分化，起抗骨质疏松作用。杨树华等[33-34]应用龟鹿二仙胶醇提物干预RAW264.7诱导的破骨样细胞，发现与生理盐水组比较，龟鹿二仙胶醇提物含药血清可降低破骨样细胞 CtsK、TRAP基因表达，提高CTR基因表达，抑制骨吸收活性。牛素生等[35]观察了龟鹿二仙胶含药血清对BMMSCs成骨分化的作用，发现10 %龟鹿二仙胶含药血清与成骨诱导液都可以促进BMMSCs向OB分化，且作用机制可能与增强Fzd-2表达、抑制Axin-2表达和激活Wnt/β-catenin通路有关。不仅如此，徐卫峰等[36]还发现龟鹿二仙胶含药血清能够保护BMMSCs细胞活性，免受地塞米松损伤，降低炎性反应。尚冰等[37]的研究较为与众不同，他们并未采用常用的含药血清作为干预手段，而是观察了不同浓度龟鹿二仙膏(10-4、10-6、10-8mol /L)对HESCs增殖和胰岛素样生长因子(IGF)-1表达的影响。结果显示，高浓度龟鹿二仙膏能够显著促进HESCs增殖活性，提升 IGF-1基因、蛋白表达。一定程度上说明了龟鹿二仙胶具有调节卵巢相关激素水平的功效，通过延缓女性衰老从而改善围绝经期女性骨质疏松。

3 现代应用迷思

3.1 相关研究量明显不足

笔者通过检索PubMed、中国知网(CNKI)、万方数据库(Wanfang Database)搜集文献，然而并未检索到任何相关英文文献。此外，作为著名填精益髓、延年益寿的名方，龟鹿二仙胶相关的中文文献数量也明显不及其他补肾经方。以CNKI旧版为例，检索日期为从建库至2020年11月11日，以“篇关摘”检索“龟鹿二仙”可得结果共计286条，同样方法检索“左归丸”(1 346条)、右归丸(1 322条)、六味地黄丸(5 325条)、地黄饮子(1 102条)、金匮肾气丸(2 232条)。个中原因颇多，但笔者推测，如此大的差异最有可能与龟鹿二仙胶药材价格相关。龟甲胶、鹿角胶、人参均为名贵药材，根据阿里巴巴自营健康医药旗舰店报价，龟甲胶(四方箄)售价为720元/盒(200 g)，鹿角胶(北京同仁堂)售价为1 026元/盒(108 g)，而金匮肾气丸(北京同仁堂)15元/盒(60 g)、六味地黄丸(仲景牌)35元/盒(360丸)，左归丸(仲景牌)65元/盒(45 g)。原材料价格昂贵、需长期服用等因素无疑抬高了龟鹿二仙胶的研究门槛，将研究经费不甚充裕的科研团队拒之门外。

3.2 临床应用方法不一

当前贯以“龟鹿二仙胶”名称的研究一定程度上存在名不符实的现象，不少研究者所用处方的组成、剂量、剂型等与龟鹿二仙胶原方相差较大，难以体现龟鹿二仙胶对于骨质疏松症的治疗作用。例如有早期研究的处方为龟板12 g、鹿角片12 g、仙灵脾12 g、威灵仙12 g、熟地12 g、肉苁蓉12 g、巴戟天12 g、黄芪12 g、党参12 g、当归12 g、红花3 g[2-3]。该方以“龟鹿”为君，另加药9味，且无人参与枸杞子，龟板与鹿角片皆未制成胶状，显然与龟鹿二仙胶原方相去甚远。此方虽以“龟鹿二仙”为名，但并不足以代表龟鹿二仙胶。又如陈治堪[6]采用了以淀粉与蜂蜜制成的龟鹿二仙胶(丸剂)，且原药材仍然是使用了未制胶的龟板与鹿角。无独有偶，齐鹏坤等[12-13]所用处方为龟板10 g、鹿角10 g、人参10 g、枸杞15 g，名为龟鹿二仙汤。龟板性寒，味甘咸，可滋肾潜阳，退虚热。而龟甲胶是由龟甲反复煎熬、浓缩制成的胶状物，性平，具有滋阴潜阳、养血补血功效。同理，鹿角制成鹿角胶后药性与功效也不可避免的发生改变，因此，所有未将“龟鹿”制成胶状物的研究能否算作是龟鹿二仙胶的现代应用研究仍有待商榷。

此外，当代医家所用龟鹿二仙胶各药的配比也是不尽相同。据第五版高等医药院校教材《方剂学》记录的《医方考》原药材配比为，鹿角(5 kg)∶龟板(2.5 kg)∶枸杞子(1.5 kg)∶人参(0.5 kg)=10∶5∶3∶1[38]，但并未言明龟板胶、鹿角胶与人参、枸杞子的具体比例。我们注意到当前四药临床配比大致为鹿角胶10～18 g、龟板胶10～18 g、人参10～20 g、枸杞子15～30 g[4-5,8,10-11]，所有文献均未注明如此使用的出处和根据。还有学者直接购买中成药“龟鹿二仙膏”进行临床试验，其配置比例更是难以考证[6-7,14]。总之，虽配比上仍有无法考据的内容，但可以肯定，直接采用龟板、鹿角制成的贯以“龟鹿二仙”名称的复方并不能较好的代表龟鹿二仙胶的临床疗效，未来研究的处方仍应遵从经典原方组成、药物剂型及药材配比。

3.3 细胞水平干预方式争议

此次检索到的所有体外实验文献绝大部分均采用了同种属动物含药血清的方式进行细胞实验。唯有尚冰等[37]采用了直接体外中药给药的方式，龟鹿二仙胶虽仅有四味中药，组方精简，但兼具植物药与动物药，化学成分十分复杂。现有相关研究数量稀少，尚无法确定龟鹿二仙胶是通过药物成分直接起效，还是经过肝脏代谢后产物发挥作用，亦或是凭借第二信使起到间接作用[39-40]。因此，也无法断言尚冰等[37]的实验方案就不如其余基于血清药理学的研究。单从目前中医药领域研究方法而言，使用血清药理学的研究认可度更高，更贴近复杂药物在内环境中的药物起效过程。然而在龟鹿二仙胶含药血清的使用上各学者间也存在些许不同。一部分学者以低、中、高三种剂量灌胃大鼠，随即将所得的相应含药血清定义为低、中、高三种[23,25-28,32,36]。而其余学者均是由同一浓度中药灌胃后提取含药血清，在干预细胞时再调整相应浓度(例如10 %、15 %、20 %等)[29-31,35]。两种方法均有各自的理论支撑点，前者模拟不同浓度药物在体内代谢，更接近现实代谢情况，而后者摒除了不同浓度药物在体内代谢的异质性，缩小了个体差异，具备更强的均一性和可重复性。由此可见，目前无论是从药物直接发挥作用，还是借助含药血清进行实验都存在难以避免的争议，将来研究除了继续探索这两种方式以外，还可关注第二信使在龟鹿二仙胶与细胞间通讯所起的作用，例如时下较热门的外泌体、微小囊泡等。

4 小结与展望

目前龟鹿二仙胶相关研究仍显匮乏，且现有研究存在临床应用方法迥异，细胞水平干预方式争议等问题，总体上缺乏准度与深度。故而将来研究可从如下几方面入手：①开展多中心、大样本、高质量的临床试验进一步验证疗效；②进行药物质控研究，规范和制定相对精准化的配方和剂量；③探索细胞水平给药方式，如细胞外囊泡等第二信使在骨细胞间通讯的作用；④优化药物制备方式，降低成本和研究门槛。龟鹿二仙胶是阴阳双补，延年益寿的名方，研究其抗骨质疏松作用对拓宽和明确中医复方应用范围大有裨益。此文旨在厘清现状，抛出重点问题，以待今后同道勠力同心，为此方正名。