尾加压素Ⅱ促进毛乳头细胞增殖及分泌血管内皮生长因子的实验研究

廖丛娟，张旭升，樊小容，谭小青，黄战军，蔡博治

近来研究发现，毛乳头细胞通过分泌许多生物活性因子如血管内皮生长因子（ VEGF ）等调节毛发的生长，在毛囊的周期性循环和毛发生长中起重要作用[1,2]。尾加压素Ⅱ（ urotensin Ⅱ，UⅡ）是一种最初发现于硬骨鱼尾部下垂体的活性肽，其分布具有种属普遍性，不同物种UⅡ的活性中心都是一个高度保守的环形六肽结构[3]。研究发现，UⅡ是一种内源性丝裂原，可促进多种细胞增殖，同时UⅡ还具有内分泌效应，可影响血浆催乳素、促甲状腺素、VEGF 等生物活性因子的分泌[4]。本实验观察了UⅡ对体外培养的毛乳头细胞增殖及分泌VEGF的影响，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 试剂

SPF级雄性SD大鼠（汕头大学医学院实验动物中心）。DMEM 高糖培养基、标准胎牛血清（Gibco公司）。胰蛋白酶（Sigma公司）。Urotensin Ⅱ（Rat，200 µg）（康肽生物有限公司）。CCK-8（碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将大鼠处死，于无菌环境下取大鼠触须皮肤，用显微剪分离大鼠触须毛囊至生理盐水中，再将触须毛囊毛球部剪下，用Ⅰ胶原酶消化分离出毛球部的毛乳头细胞。将毛乳头细胞放入T25培养瓶中进行培养。贴壁后第1天细胞开始迁出呈现放射状生长，2周后细胞绝大部分融合。可见到典型的毛乳头细胞凝集性生长的特性（图1）。

图1 毛乳头细胞培养2周后的细胞形态镜下所见（×100）

1.2.2 UⅡ对体外培养的毛乳头细胞增殖的影响将第2～4代细胞消化、台盼蓝染活细胞计数，以每孔3×103的密度接种于96孔板内，放置于培养箱内培养24 h，待细胞贴壁后，每孔加入100 μl含不同浓度UⅡ的DMEM培养基，UⅡ的浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L，对照孔加入不添加UⅡ的培养基，每个浓度设3个复孔。以铺板24 h记为测量的0 h，分别于 0、24、48和72 h采用CCK-8法测量各孔的A值。测量时去除每孔的原培养液，悬空滴加含10% CCK8的新鲜培养基，于培养箱中放置1 h后，在酶标仪上测量波段为450 nm的A值。增殖率=（含UⅡ实验孔A值-空白对照孔A值）/（不含UⅡ对照孔A值-空白对照孔A值）×100%。

1.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液中VEGF水平 取2～4代毛乳头细胞进行实验。将细胞消化、台盼蓝染色计数后调节为105个/ml细胞悬液，接种于24孔板内，每孔500 μl。将24孔板放置于5% CO2培养箱中，24 h后细胞稳定贴壁，分别加 入 含10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L UⅡ的DMEM培养基各500 μl。对照组仅加入500 μl DMEM培养基。每个浓度3个复孔。培养72 h后，换无血清培养基继续培养24 h，收集上清，用 VEGF ELISA试剂盒检测细胞培养上清中的VEGF 水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS20.0软件进行方差分析和t检验，统计变量以均数±标准差表示。

2 结果

2.1 毛乳头细胞的培养

新鲜分离的毛乳头接种于 DMEM 培养液中, 放置于5%CO2培养箱中培养。2周后绝大部分融合生长，形状似长梭形的成纤维细胞，呈凝集性生长特性（图1）。

2.2 UⅡ对毛乳头细胞增殖的影响

UⅡ10-6、10-7、10-8mol/L 可显著促进毛乳头细胞增殖（与对照组比较P＜0.05），说明UⅡ对毛乳头细胞具有促增殖作用（图2a）。随着时间延长，浓度为10-6mol /L的UⅡ对毛乳头细胞的促增殖作用明显升高，48 h及72 h毛乳头细胞的增殖率与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）（图2b）。

图2 CCK8 法检测UⅡ对体外培养的毛乳头细胞增殖的影响

2.3 不同浓度UⅡ对毛乳头细胞上清中VEGF水平的影响

10-6、10-7mol /L UⅡ组毛乳头细胞上清中分泌的VEGF水平高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 不同浓度U II对毛乳头细胞上清中VEGF水平的影响 （n=3，¯x ±s）

3 讨论

毛乳头细胞是一种生长于毛囊基底部的真皮源性细胞，通过分泌许多生物活性因子形成信号分子网络，对毛囊的生长周期和毛发生长起重要调控作用[5]。VEGF是毛乳头细胞分泌的多种生物活性因子中的一种，体外培养的毛乳头细胞能高水平表达VEGF。VEGF 及其受体的表达与毛细血管的形成有关，是与血管新生有关的最重要的靶基因之一[6]。在毛发生长周期中，VEGF 的表达和消失与毛球部血管的生成和消失保持一致[7]。有研究报道，VEGF通过诱导毛囊周围血管形成而调控毛囊的周期性循环和促进毛发生长[8]。因此，对促进毛乳头细胞分泌VEGF的研究是值得关注的。

UⅡ具有许多生理学效应，例如刺激平滑肌细胞、心肌成纤维细胞、肾系膜细胞等增殖，促进心肌成纤维细胞分泌纤维连接蛋白以及Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白[9]。文献报道，UⅡ可诱导缺氧人脐静脉内皮细胞表达VEGF，诱导外膜成纤维细胞分泌VEGF[10,11]，提示UⅡ很可能是促进毛乳头细胞分泌VEGF的重要因子。

本实验采用体外分离培养的大鼠毛乳头细胞，检测不同浓度UⅡ对体外培养的毛乳头细胞分泌VEGF水平的影响。研究结果表明，10-6、10-7、10-8mol /L UⅡ可显著促进毛乳头细胞增殖，说明UⅡ对毛乳头细胞具有促增殖作用，且呈时间依赖性。但UⅡ对毛乳头细胞的促增殖作用没有剂量依赖性，其原因可能是高浓度的UⅡ对毛乳头细胞有一定毒性，影响了毛乳头细胞的凋亡，因此只有适当浓度的UⅡ可促进毛乳头细胞增殖。同时，10-6、10-7mol /L UⅡ处理毛乳头细胞可明显地干预VEGF表达，提示UⅡ被开发为一种新的促进毛发生长药物的潜在可能性，其机制可能与促进毛乳头细胞分泌 VEGF 从而促毛发生长有关。

毛乳头细胞上可表达多种生长因子受体，如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子受体（HGF）、VEGF 受体等。下一步笔者将检测UⅡ对其他生长因子受体分泌水平的影响，并集中研究UⅡ具体是通过哪一种信号通路对毛乳头细胞的生长和增殖进行调节。