盐碱胁迫下外源H2O2对毛白杨生理特性的影响

任金兰

（山西省关帝山国有林管理局屯兰川林场，山西古交030208）

0 引言

土壤盐碱化是造成土壤肥力降低的主要因素[1]。据报道，世界盐碱化土壤面积达到了9.54×108hm2，中国盐碱化土地面积也达到了3.7×107hm2，土壤盐碱化已经成为毛白杨人工造林的限制因子[2]，研究外源过氧化氢对复盐胁迫下毛白杨的生理响应机制，可以为毛白杨盐碱地人工造林提供理论依据。从关帝山林区调研结果看，NaCl和NaHCO3是造成土壤盐碱化的主要物质[3]。胡化广[4]研究了盐碱胁迫下结缕草生理变化，结果表明，结缕草CAT活性、脯氨酸含量、电导率均表现出升高的变化，SOD、可溶性糖表现出先升高后降低的变化；崔雪梅[5]研究认为，盐碱胁迫抑制了油菜的生长，显著提高了叶片内的可溶性糖含量，脯氨酸含量虽然升高但是与对照之间无显著差异；张若晨[6]研究了盐碱胁迫下大果榉幼苗保护酶活性变化，结果表明，随着盐碱浓度的增加，POD、SOD活性表现出先升高后降低的变化；袁驰[7]研究了水稻对盐碱胁迫的影响规律，结果表明，丙二醛、脯氨酸均随着盐碱浓度的增加而升高。盐碱胁迫相关研究集中在盐碱对植物种子萌发和幼苗生理特性的影响，关于盐碱胁迫对植物生长季节影响的相关报道较少。毛白杨是山西省人工林建设的主要树种[8]，研究毛白杨耐盐碱的理论基础具有重要的实践意义。过氧化氢是植物响应环境胁迫的重要信号分子[9]，Bright[10-11]研究认为，外源 H2O2可以有效缓解逆境下黄瓜叶绿体膜的伤害；Andre-dias[12]研究认为，外源H2O2可以提高玉米的耐盐性；刘建新[13]研究认为，H2O2提高了燕麦的耐碱性，这可能与外源H2O2会影响植物基因表达有关[14]。在前人的相关研究中鲜见盐碱胁迫下外源过氧化氢对毛白杨生理响应机制影响的报道。笔者通过研究外源过氧化氢对盐碱胁迫下毛白杨的生理活性物质的影响，探讨外源过氧化氢提高植物抗逆性的机理，旨在为改进栽培措施提高毛白杨抗逆性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

室外试验于2019年4—8月在屯兰川林场试验苗圃内全日光温室内进行，室内生理指标测验于取样后第2～5天在生理生化实验室内进行。

1.2 试验材料

试验所选毛白杨为1年生扦插苗，该苗木于2018年4月在苗圃内扦插育苗，至2019年4月自然条件下生长1年。2019年4月6日，人工用铁锹起苗，然后用自来水洗净根系上的泥土，用吸水纸保湿备用。准备口径32 cm、深40 cm的塑料盆，装好珍珠岩，然后将洗净的毛白杨苗木栽植其中，每盆栽植1株。栽植完成后，每盆浇500 mL的Hoagland营养液[15]，然后全部置于日光温室内培养，每隔4天浇水1次，防止苗木发生干旱胁迫，一直培养至6月25日进行盐碱胁迫处理。

1.3 试验设计

试验共设计4个处理，H1为对照，处理时浇灌等量的Hoagland营养液；H2为营养液与盐碱溶液处理，Hoagland营养液+80 mmol/L NaHCO3+60 mmol/L NaCl；H3为盐碱胁迫+过氧化氢处理，即Hoagland营养液+80mmol/LNaHCO3+60mmol/LNaCl+100μmol/L H2O2；H4为营养液+过氧化氢处理，即Hoagland营养液+100 μmol/L H2O2。自2019年6月25日开始，每盆浇灌试验设计的溶液400 mL，每隔3天浇1次，浇灌3次后的第2天（即7月4日）取样一次，浇灌6次后的第2天（即7月16日）取样一次，测定各项生理指标变化情况。试验所选用NaHCO3和NaCl均为分析纯，所选用的H2O2为30%浓度。试验每处理共30盆，3次重复，各处理在温室内随机排列。

1.4 试验取样及测定项目

分别于7月4、16日取样，每处理随机选择6株苗木，将全部叶片摘取后放入液氮中冷冻保存，带回实验室后进行相关生理指标的测定。其中超氧阴离子测定采用羟胺氧化法[16]，H2O2含量测定采用分光光度法[17]，相对电导率采用电导仪法[16]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[17]，SOD活性测定采用NBT光化还原法[18]，CAT活性测定采用紫外吸收法[18]，POD活性测定采用愈创木酚法[18]，APX活性采用紫外分光光度法[18]，ASA含量测定采用红菲咯啉比色法[18]，GSH含量测定采用TDNB法[18]，可溶性糖测定采用蒽酮比色法[18]，可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法[18]，游离脯氨酸含量测定采用茚三酮法[18]。

1.5 试验仪器及试剂

试验所用紫外光分光光度计型号为2102C型，由尤尼柯（上海）仪器有限公司生产，2017年3月购入；茚三酮由上海芃硕生物科技有限公司生产，2019年1月购入；硫代巴比妥酸由上海源叶生物科技有限公司生产，2019年1月购入；30%过氧化氢由天津市大茂化学试剂厂生产，2019年3月购入；DDSJ-308A型电导率仪于2019年2月从上海仪电科学仪器股份有限公司购入。

1.6 数据分析

数据分析以及表格制作使用Excel 2010版软件，方差分析使用DPS 7.05软件。

2 结果与分析

2.1 外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨超阴离子和内源H2O2含量的影响

由表1可知，随着盐碱溶液处理次数增加，超氧阴离子和过氧化氢含量增加，不同处理间存在差异。从超氧阴离子含量变化看，7月4日和7月16日，H2处理处于最高值，与H1处理相比分别提高了1.83、2.07 μg/g，差异显著，说明盐碱胁迫显著提高了毛白杨叶片内的超氧阴离子含量；H3处理与H2处理相比分别降低了0.53、0.67 μg/g，差异显著，表明外源H2O2可以降低叶片内超氧阴离子含量，效果显著；H3与H4相比分别提高了1.36、1.45 μg/g，说明在相同H2O2处理下，盐碱胁迫导致毛白杨超氧阴离子含量的显著升高；H4处理分别低于H1处理0.06、0.07 μg/g，无显著差异，说明一定浓度的外源H2O2不会对毛白杨叶片内的超氧阴离子产生显著影响。从内源过氧化氢含量变化看，H2处理分别比H1处理提高了1.28、1.45 mg/g，差异显著，说明盐碱胁迫会显著提高毛白杨叶片内的内源H2O2含量；H3处理分别比H2处理降低了0.71、0.69 mg/g，差异显著，说明外源H2O2会显著降低毛白杨叶片内源H2O2含量；H4处理分别低于H2处理0.12、0.16 mg/g，无显著差异，说明外源H2O2在一定程度上会降低毛白杨叶片内内源H2O2含量，但是效果不显著。

表1 毛白杨超氧阴离子和内源H2O2含量分析表

2.2 外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨相对电导率和MDA含量的影响

由表2可知，随着盐碱溶液浇灌量的增加，毛白杨相对电导率和MDA含量均升高。从相对电导率变化看，7月4、16日，H2处理分别高于H1处理57.84和52.87个百分点，差异显著，说明盐碱胁迫显著提高了毛白杨叶片内的相对电导率；H3处理分别比H2处理降低了7.50和4.53个百分点，无显著差异，表明外源H2O2对缓解盐碱胁迫降低相对电导率有一定的作用，但是效果不显著；H4处理分别低于H1处理6.46和7.53个百分点，无显著差异，表明外源H2O2对降低毛白杨叶片相对电导率具有一定的作用。从MDA含量变化看，H2处理分别比H1处理提高了7.90、9.73 nmol/g，差异显著，说明盐碱胁迫显著提高了毛白杨叶片相对电导率；H3处理分别低于H2处理1.20、1.76 nmol/g，无显著差异，说明外源H2O2有利于降低毛白杨的MDA含量；H4处理分别高于H1处理1.02、1.12 nmol/g，差异不显著，说明外源H2O2一定程度上会提高毛白杨叶片内MDA含量，但是效果不显著。H4处理相对电导率和MDA含量均显著低于H2处理，并且与H1处理之间无显著差异，说明外源H2O2对毛白杨的影响显著小于盐碱胁迫。从相对电导率和MDA含量变化看，外源H2O2一定程度上可以缓解盐碱胁迫对毛白杨细胞膜的伤害。

表2 毛白杨相对电导率和MDA含量分析表

2.3 外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨保护酶活性的影响

由表3可知，毛白杨叶片内保护酶活性随着盐碱处理次数的增加而升高，不同保护酶对外源H2O2的响应存在差异。从SOD活性变化看，7月4、16日H2分别比H1提高了5.88、9.13 U/g，差异显著，说明盐碱胁迫显著提高了毛白杨叶片内的SOD活性；H3处理分别高于H2处理4.52、5.52 U/g，差异显著，说明外源H2O2与无H2O2处理相比可以显著提高SOD活性，对降低毛白杨盐碱胁迫具有重要作用；H4处理分别高于对照3.10、4.36 U/g，无显著差异，表明外源H2O2对提高毛白杨SOD活性具有一定的促进作用，但效果不显著。H2处理POD活性与H1相比分别提高了1.67、6.85 U/g，H3处理分别比H2处理提高了3.11、1.28 U/g，差异显著，说明外源H2O2对提高盐碱胁迫下毛白杨POD活性效果显著；H4处理POD活性与对照之间无显著差异，说明外源H2O2与H1处理相比不会对毛白杨POD活性产生显著影响。CAT活性变化与POD相同，其中H2处理分别高于H1处理1.10、1.81 U/g，差异显著，说明盐碱胁迫提高了毛白杨CAT活性；H3处理分别高于H2处理2.37、1.20 U/g，差异显著，说明外源H2O2会对盐碱胁迫下毛白杨CAT活性产生显著影响；H4处理分别高于H1处理0.28、0.15 U/g，无显著差异，说明外源H2O2与H1处理相比不会显著影响毛白杨CAT活性。盐碱胁迫提高了毛白杨APX活性，其中H2处理分别比H1处理提高了2.30、2.20 U/g，差异显著；H3处理分别高于H2处理3.20、3.18 U/g，差异显著，表明外源H2O2对提高APX活性具有显著作用；H4处理分别高于H1处理0.77、0.65 U/g，无显著差异，说明一定浓度的外源H2O2不会对APX产生显著影响。

表3 毛白杨保护酶活性变化分析表 U/g

2.4 外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨活性氧清除系统的影响

由表4可知，AsA和GSH含量随着盐碱处理次数的增加而升高，不同处理对2种生理活性物质含量的影响也存在差异。7月4、16日，H2处理AsA分别高于H1处理0.25、0.27 mg/g，无显著差异，说明盐碱胁迫提高了AsA含量，但效果不显著；H3处理分别高于H2处理0.76、0.86 mg/g，无显著差异，说明外源H2O2与盐碱胁迫处理相比对提高AsA含量有一定作用，但是效果不显著，与H1处理相比显著提高了AsA含量；H4处理分别比H1处理提高了2.40、2.21 mg/g，差异显著，说明外源H2O2与H1处理相比显著提高了AsA含量。GSH含量变化与AsA存在差异，其中H2处理分别比H1处理提高了0.08、0.10 mg/g，差异显著，说明盐碱胁迫显著提高了毛白杨叶片内GSH含量；H3处理分别低于H2处理0.02、0.03 mg/g，无显著差异，表明外源H2O2对降低盐碱胁迫下GSH含量有一定的作用；H4处理分别低于H1处理0.06、0.04 mg/g，其中7月4日差异显著，说明外源H2O2与H1处理相比对降低毛白杨叶片GSH含量具有一定的作用。

表4 毛白杨AsA和GSH含量分析表 mg/g

2.5 外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨渗透物质含量的影响

由表5可知，随着盐碱胁迫处理次数的增加，毛白杨渗透物质含量升高，不同处理对渗透物质含量的影响存在差异。7月4、16日，H2处理可溶性糖含量分别比H1处理提高了96.74、110.82 mg/g，差异显著，表明盐碱胁迫显著提高了毛白杨可溶性糖含量；H3处理分别低于H2处理29.82、27.27 mg/g，其中7月4日2个处理之间差异显著，7月16日差异不显著，说明外源H2O2有利于缓解盐碱胁迫并降低可溶性糖含量；H4处理分别高于H1处理14.92、9.58 mg/g，其中7月4日差异显著，7月16日差异不显著，同时，H4处理显著低于H2、H3处理。H2处理可溶性蛋白含量分别高于H1处理1.45、0.97 mg/g，差异显著，表明盐碱胁迫显著提高了毛白杨可溶性蛋白含量；7月4日，H3处理高于H2处理1.66 mg/g，差异显著，表明外源H2O2在7月4日可以显著提高毛白杨叶片内可溶性蛋白含量，7月16日H3处理低于H2处理0.56 mg/g，无显著差异，表明外源H2O2在7月16日不会对可溶性蛋白产生显著影响。游离脯氨酸含量H2处理分别高于H1处理3.87、3.56 mg/g，差异显著，表明盐碱胁迫显著提高了毛白杨渗透物质含量；H3处理分别高于H2处理5.85、8.11 mg/g，差异显著，表明外源H2O2与盐碱胁迫处理相比显著提高了毛白杨游离脯氨酸含量；H4处理分别比H1处理提高了2.42、4.56 mg/g，差异显著，表明外源H2O2会显著提高毛白杨游离脯氨酸含量。

表5 毛白杨渗透物质含量分析表 mg/g

3 结论

（1）盐碱胁迫会显著提高毛白杨叶片内超氧阴离子和过氧化氢含量，外源H2O2处理与盐碱胁迫处理相比显著降低了超氧阴离子和过氧化氢含量，外源H2O2处理与对照相比不会对超氧阴离子和过氧化氢含量产生显著影响。

（2）盐碱胁迫会显著提高毛白杨相对电导率和MDA含量，外源H2O2会降低相对电导率，对MDA含量影响不显著；外源H2O2与对照相比不会对相对电导率和MDA含量产生显著影响。

（3）盐碱胁迫显著提高了SOD、APX活性，外源H2O2与盐碱胁迫处理相比均可以提高毛白杨保护酶活性；外源H2O2与对照相比不会对SOD和APX活性产生显著影响，显著提高POD、CAT活性。

（4）盐碱胁迫不会显著影响AsA含量，外源H2O2与盐碱处理相比提高了AsA含量，与对照相比提高效果显著；盐碱胁迫显著提高了GSH含量，外源H2O2与盐碱胁迫处理相比降低了GSH含量，外源H2O2与对照相比不会对GSH含量产生显著影响。

（5）盐碱胁迫显著提高了毛白杨可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量，外源H2O2与盐碱胁迫处理相比降低了可溶性糖含量，显著提高了可溶性蛋白、游离脯氨酸含量；外源H2O2与对照相比显著提高毛白杨渗透物质含量。

（6）从毛白杨抗逆机理看，外源H2O2可以缓解盐碱胁迫，提高活性氧清除系统活性，调节渗透平衡。

4 讨论

武敬亮[19]研究认为，植物在盐碱胁迫下膜脂过氧化水平会显著升高，使植物细胞膜受到破坏，从而影响其功能的发挥，严重时植物会死亡。本试验研究中，盐碱胁迫均显著提高了毛白杨超氧阴离子和内源H2O2含量，说明盐碱胁迫导致氧负基离子的积累，而过多的氧负离子积累不仅会对细胞膜系统造成不可逆的伤害，也会严重抑制光合作用的进行，从而影响植物的正常生长发育[20]。外源H2O2可以显著降低超氧阴离子和内源过氧化氢含量，从而降低毛白杨相对电导率，延缓MDA积累，这与刘建新[21]的研究结果相似，说明外源H2O2对降低毛白杨盐碱胁迫下膜脂过氧化水平，以保护膜系统不受伤害，维持植物体正常生理代谢的进行。从SOD的作用看，其活性的提高可以将更多的超氧阴离子转化为过氧化氢和氧气，而其他保护酶通过协同作用将过氧化氢转化为水，AsA和GSH直接参与过氧化氢的转化，因此保护酶活性的提高可以防止植物遭受逆境伤害[22]。本研究中，外源H2O2均提高了毛白杨各保护酶活性，其中SOD和APX均达到了显著水平，说明外源过氧化氢在一定程度上可以提高超氧负离子和内源过氧化氢的转化效率，从而缓解毛白杨在盐碱胁迫下受到的伤害[23]。谷文英[24]研究认为，保护酶活性提高可以促进盐碱胁迫下植物逆境蛋白的表达，从而有利于植物抗逆性提高；从毛白杨盐碱胁迫生理响应机制看，SOD、POD、APX、CAT在盐碱胁迫下均会显著升高，这与张晓龙[25]的研究结果相似，表明逆境胁迫下植物保护酶活性升高是毛白杨对盐碱胁迫的重要生理响应机制。张波[26]研究认为，外源H2O2对提高小麦可溶性糖含量效果显著，同时也可以显著提高GSH含量来提高植株的抗逆能力，而本研究与之存在差异，这可能与不同植物对外源过氧化氢的生理响应机理不同有关。从本试验研究结果看，外源H2O2显著提高了可溶性蛋白含量，对提高其抗盐碱能力具有重要作用，出现这种现象的原因，除外源H2O2能促进抗逆蛋白表达有关外，还与外源H2O2抑制活性氧产生，从而影响蛋白酶活性升高抑制了可溶性蛋白降解有关[27]。外源H2O2提高了毛白杨游离脯氨酸含量，这与武术杰[28]的研究结果相似，这与外源H2O2可以激活谷氨酸途径和鸟氨酸途径促进游离脯氨酸的合成有关[29]。本研究探讨了毛白杨对外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨的生理响应机制，在后续的研究中，需要围绕毛白杨生理变化的机理进行深入研究，这对填补相关的基础理论研究空白具有一定意义。